Бесплодие в супружеских парах встречается в 15–25% случаев, что является серьезной социальной проблемой. По мнению экспертов ВОЗ, частота бесплодия выше 15% может отразиться на демографических показателях страны. В связи с этим к данной проблеме привлечено внимание различных специалистов – эндокринологов, акушеров-гинекологов, урологов, андрологов, занимающихся разработкой новых технологий лечения. Метод лечения бесплодия путем экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) является одним из наиболее эффективных. Cнижение результативности ЭКО может быть связано с недостаточностью эндометрия (рефрактерный эндометрий, гипоплазированный эндометрий, синдром Ашермана) и его нечувствительностью из-за перенесенного хронического субклинического эндометрита, повторных выскабливаний матки, оперативных вмешательств в связи с проведением консервативной миомэктомии, а также в связи с другими патологическими процессами [1–4].
Недавние исследования показали высокую распространенность у бесплодных пациентов хронического эндометрита – до 46%, а также его взаимосвязь с рецидивирующим абортом и повторной имплантационной недостаточностью [5, 6].
Проблема лечения хронических эндометритов сохраняет свою актуальность в связи с недостаточной эффективностью существующих методов лечения и неизвестной длительностью заболевания. Несмотря на широкий спектр применяемых вариантов консервативного лечения этой патологии (антибиотики, синтетические эстроген-гестагенные препараты), эффект их остается относительно невысоким, что ограничивает или снижает эффективность методов лечения бесплодия, в том числе и вспомогательных репродуктивных технологий.
Новым подходом в лечении данного заболевания представляются вновь разрабатываемые методы регенеративной медицины, из которых одним из наиболее доступных и перспективных на сегодняшний день считается применение плазмы, обогащенной растворимыми факторами тромбоцитов (ПОРФТ) [7]. Она является аутологичным биотерапевтическим препаратом периферической крови, оказывающим регенеративное действие на поврежденные ткани за счет повышенного содержания факторов роста, противовоспалительных цитокинов, антимикробных субстанций [8]. При лечении эндометрита эффект заживления связывают с наличием в ПОРФТ трансформирующего ростового фактора β (TGF-β1 и TGF-β2), тромбоцитарных ростовых факторов (PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB), инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-I), эпидермального фактора роста (EGF), фактора роста фибробластов (FGF), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Эти факторы роста действуют синергически, предотвращая апоптоз клеток, оказывая противовоспалительный эффект и содействуя ангиогенезу [9]. Поскольку ПОРФТ получают из аутологичной крови, то риск передачи болезней, иммуногенных реакций минимизирован. Имеются исследования, доказывающие эффективность ПОРФТ при заживлении ран и регенерации тканей в ортопедии, стоматологической практике, офтальмологии, реконструктивной хирургии. Исследования, проведенные на коровах, показали, что аутологичная ПОРФТ, или platelet-rich plasma (PRP), вызывает восстановление рецепторов к прогестерону, пролиферацию клеток эндометрия, подавление воспаления, вызванного бактериальными эндотоксинами [10]. В клинических наблюдениях показано, что ПОРФТ оказывает лечебное действие на слизистую матки женщин при синдроме Ашермана и восстанавливает ее нормальную гистологическую структуру и функцию [11]. Это связывают со способностью аутологичной ПОРФТ стимулировать рост эндометрия, повышать чувствительность к гормонам и способность к имплантации, улучшать васкуляризацию эндометрия, оказывать противовоспалительное и антибактериальное действие, стимулировать эндометриальные стволовые клетки.
Несмотря на краткую историю развития этого направления, применение ПОРФT/PRP можно рассматривать как эффективное средство восстановления функции эндометрия для обеспечения имплантации зародыша при проведении процедуры ЭКО [12].
Материалы и методы
В течение 2017–2018 гг. мы провели собственные исследования по изучению возможности применения аутологичной ПОРФТ с целью повышения эффективности процедур ЭКО при бесплодии у женщин с хроническим эндометритом в анамнезе. В исследование были включены 137 пациенток с бесплодием, ассоциированным с хроническим эндометритом, у которых имелись показания для ЭКО. Исследование проводилось на базе УЗ «Клинический родильный дом №2» г. Минска. Дизайн планируемых исследований был рассмотрен и одобрен этической комиссией «Клинического родильного дома №2», протокол №9 от 16.01.2017.
Критерии включения: пациентки репродуктивного возраста с бесплодием и хроническим эндометритом в анамнезе, подтвержденным морфологически, взятые в цикл ЭКО. Критерии исключения: пациентки с низким качеством эмбрионов. Все пациентки, включенные в исследование, подписывали информированное согласие на применение аутологичной ПОРФТ в цикле ЭКО.
При проведении исследования использовались следующие методы: клинический, инструментальный, лабораторный, статистический. Дизайн исследования: выборочное, проспективное.
На 6–9-й день менструального цикла с помощью аспирационного зонда «Юнона» или пайпель-катетера производилась аспирационная биопсия эндометрия. Морфологическое исследование эндометрия проводилось двумя методами: световой микроскопией мазка и иммуногистохимией. В гистологических ответах пациенток, взятых в исследование, присутствовали следующие изменения: наличие лимфоидных инфильтратов, состоящих преимущественно из лимфоидных элементов, расположенных вокруг желез и кровеносных сосудов, – у 87 (63,5%) пациенток; в ряде случаев – у 74 (54,9%) – с «лимфоидными фолликулами». Фиброз стромы отмечался у 30 (22,1%), склероз стенок спиральных артерий эндометрия – у 45 (32,6%) пациенток. Указанные морфологические изменения отмечались в различных сочетаниях, что являлось морфологическим подтверждением перенесенного хронического эндометрита. Методом иммуногистохимических исследований определялась экспрессия CD138 (кластер дифференциации 138: мембранный белок, использующийся в качестве иммунологического маркера плазматических клеток).
Все пациентки с хроническим эндометритом были пролечены курсом противовоспалительной терапии, согласно действующим протоколам, и через 2–3 месяца после лечения производилась повторная аспирационная биопсия эндометрия с последующим морфологическим исследованием.
По критериям включения и исключения были сформированы 2 группы наблюдения. Пациенткам обеих групп стимуляция яичников проводилась с применением длинных и коротких протоколов контролируемой овариальной стимуляции, в зависимости от показаний и сопутствующей гинекологической патологии. Перенос эмбрионов осуществлялся как в лечебных циклах стимуляции яичников, так и в криоциклах.
В 1-ю группу вошли пациентки, которым в циклах стимуляции не вводилась аутологичная ПОРФТ (n=43). Эта группа явилась группой сравнения для 2-й группы пациенток. Вторую группу составили пациентки, которым на 6–10-й день стимулированного или синхронизированного цикла в асептических условиях, без обезболивания внутриматочно вводилась аутологичная ПОРФТ (n=94).
Приготовление аутологичной ПОРФТ проводилось по следующей методике: 1) взятие венозной крови в объеме 9,0 мл в пробирку, содержащую в качестве антикоагулянта 3,8% раствор цитрата натрия в количестве 1,0 мл, после чего венозную кровь центрифугировали в течение 10 минут в режиме 1500 оборотов в минуту (286 g); 2) в стерильных условиях осуществляли отбор в стерильную пробирку полученной после центрифугирования плазмы и осуществляли ее повторное центрифугирование в течение 10 минут в режиме 5000 (2800 g) оборотов в минуту; 3) из пробирки удаляли верхние 2/3 супернатанта (плазму, обедненную тромбоцитами), а оставшуюся, обогащенную тромбоцитами плазму (1/3) набирали посредством стерильного внутриматочного катетера в шприц в объеме 1,0–1,5 мл; 4) за 4–5 минут до введения в матку пациентки к аутоплазме, обогащенной тромбоцитами, добавляли 100 мкл 10% стерильного раствора глюконата кальция.
Введение ионов кальция в данном случае является фактором активизации тромбоцитов, в результате которого происходит выброс из везикуло-тубулярной системы тромбоцитов биологически активных соединений и факторов роста, то есть обогащение аутоплазмы растворимыми ростовыми факторами тромбоцитов. Внешне это проявлялось приобретением гелеобразной консистенции аутоплазмы, вводимой в полость матки. Заявка на изобретение «Способ подготовки пациентов к процедуре экстракорпорального оплодотворения» № а20170163 от 16.05.2017 г.
Статистический анализ полученных данных проводился с использованием параметрических и непараметрических методов исследования, в том числе методов описательной статистики, оценки достоверности (t-критерий Стьюдента; Chi-square, χ²). Критическое значение уровня значимости принималось равным 5% (p=0,05). Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием пакета прикладных программ Statistica 10.
Результаты и обсуждение
Сформированные группы были однородны по возрасту (Chi-square test: χ2=2,31, p=0,128). В 1-й группе – ЭКО без применения ПОРФТ (43 пациентки) и во 2-й группе — ЭКО с применением ПОРФТ (94 пациентки) преобладали пациентки в возрасте до 35 лет, удельный вес которых составил 53,5% и 67,0% соответственно. Хронический эндометрит у пациенток обеих групп был подтвержден морфологически. Все пациентки прошли курс лечения хронического эндометрита согласно действующим клиническим протоколам. Через 2–3 месяца после окончания лечения проводилась контрольная аспирационная биопсия эндометрия. Признаков хронического эндометрита после лечения не было выявлено у 16 (37,2%) пациенток 1-й группы и у 35 (37,2%) пациенток 2-й группы. Остаточные морфологические признаки эндометрита были выявлены у 27 (62,8%) пациенток 1-й группы и у 59 (62,8%) пациенток 2-й группы. В 1-й группе 27 (63%) пациенткам были перенесены эмбрионы на 5-е сутки на стадии бластоцисты, а 16 (37%) – на 3-и сутки на стадии дробления. Во 2-й группе 54 (57,4%) пациенткам были перенесены эмбрионы на 5-е сутки на стадии бластоцисты, а 40 (42,6%) – на 3-и сутки на стадии дробления. Один эмбрион был перенесен 16 (37,2%) пациенткам 1-й группы, 2 эмбриона – 27 (62,7%) 1-й группы. Во 2-й группе один эмбрион был перенесен 52 (55,3%) пациенткам, 2 эмбриона – 41 (43,6%) и 3 эмбриона – 1 (1,1%) пациентке. Средний возраст исследуемых составил в группе ЭКО без применения плазмы 34,4 года (95% ДИ 32,8–35,9), с применением плазмы — 33,0 года (95% ДИ 32,2–33,9). По количеству попыток в обеих группах анализ статистических данных не выявил значимых различий. В группе без применения плазмы средний уровень составил 1,6 (1,4–1,8), в группе с применением плазмы – 1,8 (1,5–2,1).
В группе пациенток с применением в цикле ЭКО ПОРФТ (2-я группа) удельный вес женщин с наступившей беременностью составил 64,9% (61 из 94): 12,8% – с биохимической и 52,1% – с клинической. В группе ЭКО без применения ПОРФТ (1-я группа) удельный вес женщин с наступившей беременностью составил 32,6% (14 из 43 пациенток): 7% – с биохимической и 25,6% – с клинической (табл. 1, 2).
Следует отметить, что удельный вес женщин с наступившей беременностью статистически значимо выше (Chi-square test: χ2да-нет=12,45, p=0,0004) в группе пациентов с применением плазмы, чем в группе пациентов без применения плазмы (32,6%), и составляет 64,9%.
Установлено, что частота родов в группе пациентов с применением ПОРФТ составила 41,3% (95% ДИ 31,2–51,4) случаев на 100 пациентов и была статистически значимо выше (Chi-square test: χ2=8,26, p=0,004; t=3,28; p<0,05), чем в группе пациентов без применения плазмы (16,3% (95% ДИ 5,2–27,3) случаев на 100 пациентов).
Наши исследования показывают, что использование аутологичной ПОРФТ воздействует на процессы воспаления и репарации структур эндометрия. Ростовые факторы тромбоцитов, выброс которых происходит из везикулярно-тубулярной системы тромбоцитов при их активации ионами кальция, оказывают местные противовоспалительный и регенераторный эффекты на поврежденный хроническим воспалением эндометрий. Наши клинические наблюдения показывают, что локальное применение аутологичной ПОРФТ повышает частоту успешной имплантации эмбриона при проведении процедуры ЭКО на 15–25% по сравнению с традиционными протоколами. Аутологичная ПОРФТ при местном введении в полость матки женщинам с бесплодием, ассоциированным с хроническим эндометритом, улучшает пролиферацию и рецептивность эндометрия, тем самым значительно улучшая исходы ЭКО.
Заключение
Полученные результаты формируют новое отношение к внедрению в практику современных методов регенераторной медицины, модифицирующих циклы ЭКО и, несомненно, повышающих их эффективность. Простота получения препарата из аутоплазмы периферической крови пациентки, отсутствие побочных эффектов, возможность сочетания с препаратами стимуляции яичников, высокая эффективность, применение непосредственно в циклах стимуляции и простота введения дают возможность данной методике претендовать на включение в протоколы ЭКО в циклах стимуляции у женщин с хроническим эндометритом в анамнезе.
