Качественная оценка эмбрионов на стадии бластоцисты является обязательным этапом отбора эмбрионов перед имплантацией в рамках процедуры экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).
Активация эмбрионального генома носит генноспецифичный характер, начинается на стадии двух бластомеров для обеспечения последующего деления клеток эмбриона и переходит ко второй фазе выраженных изменений транскрипционного профиля на 4–8 клеточной стадиях развития, отражающих начало динамических морфологических изменений и приводящих к образованию бластоцисты [1, 2, 3]. Сравнение транскрипционного профиля отдельных эмбрионов человека на стадии четырех бластомеров и на стадии бластоцисты показало, что для каждой из этих стадий транскриптом специфичен, при этом транскриптомы отдельных эмбрионов, находящихся на одной и той же стадии развития, могут существенно различаться [4].
Влияние различных факторов на экспрессию генов бластоцисты человека в контексте вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ)
Наиболее изученными причинами неудачной имплантации эмбрионов в ходе ЭКО являются хромосомные аномалии эмбриона, асинхронность жизненной стадии эмбриона и «имплантационного окна» эндометрия матки, а также факторы, связанные с проведением самой процедуры ЭКО [5, 6, 7]. Сбои в активации собственного генома бластоцисты также могут обуславливать неспособность бластоцисты к имплантации и неблагоприятный исход беременности. Оценка транскрипционного профиля бластоцисты перед имплантацией и определение взаимосвязи с наступлением беременности позволит получить информацию о наличии или отсутствии аномалий экспрессии эмбрионального генома. Отбор бластоцист с наивысшим потенциалом к наступлению беременности снизит необходимость повторных переносов эмбрионов, а также частоту нежелательных многоплодных беременностей, которые являются следствием переноса нескольких бластоцист.
Активация эмбрионального генома зависит как от параметров гаметогенеза супружеской пары, так и от средовых факторов; как следствие, от указанных факторов могут зависеть успешная имплантация бластоцисты и исход беременности. Одним из наиболее значимых факторов, с которыми сталкиваются пациенты ВРТ, является снижение вероятности наступления беременности с увеличением возраста пациентки. [8]. Задокументирована прямая корреляция между возрастом матери и частотой хромосомных анеуплоидий эмбриона, приводящих к самопроизвольному прерыванию беременности [9, 10]. Группа ученых из Японии исследовала зависимость уровня экспрессии генов эмбриона в преимплантационном периоде от возраста матери [11]. В исследовании приняли участие 9 супружеских пар, у которых было получено 22 эмбриона на стадии бластоцисты с применением метода интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ). Использование метода РНК-секвенирования единичной клетки и биоинформатического анализа позволило выявить гены, уровень экспрессии которых был статистически достоверно снижен у пациенток старше 35 лет. Выявленные гены связаны с процессами сборки хроматина, организации хромосом и сегрегации гомологичных хромосом, созданием ДНК-белкового комплекса. Всего идентифицировано более 800 генов со сниженной экспрессией в группе пациенток старше 35 лет. Среди них – гены, кодирующие белок секурина, препятствующий возникновению хромосомных аномалий в митозе и мейозе, и киназу Aurora, обеспечивающую корректное взаимодействие между хромосомами и микротрубочками. Также выявлена обратная корреляция уровня экспрессии генов аутофагии и роста эмбриона с возрастом пациентки. Достоверной корреляции между уровнем экспрессии генома бластоцисты и возрастом отца выявлено не было.
Статистически значимое снижение уровня экспрессии генов бластоцист, полученных от пациенток старше 42 лет, по сравнению с группой пациенток до 30 лет описано в работе McCallie B.R. et al. [12]. Исследование выполнено на материале 12 бластоцист, полученных методом ИКСИ от 12 пациенток старше 42 лет, и 12 бластоцист от шести пациенток младше 30 лет в качестве группы сравнения. По результатам исследования обнаружены 2688 транскриптов, дифференциально экспрессирующихся в рассматриваемых группах. Для 2551 из них (что составляет 95%) уровень экспрессии оказался снижен у пациенток старшей возрастной группы. В бластоцистах пациенток старше 42 лет статистически значимо снижена экспрессия таких генов, как TNFRSF10A, задействованный в регуляции клеточного апоптоза, TSPAN9, значимый для процессов регуляции активации клеток иммунной системы, генов семейства HDAC, задействованных в формировании структуры хроматина, генов ВМР-опосредованного сигнального пути и других (перечень генов приведен в оригинальной публикации).
Наряду с возрастом пациентки факторами, влияющими на транскриптом бластоцисты, имплантацию и исход беременности, могут выступать клинико-анамнестические параметры отца и матери. В работе [13] изучена экспрессия генов бластоцист, полученных от пациентов с поликистозом яичников, мужским бесплодием и идиопатическим бесплодием. В каждую из трех групп, а также в группу контроля включено 50 криоконсервированных бластоцист. Исследование транскриптома проводилось на пуле бластоцист с применением микрочипов. Обнаружена высокая степень корреляционных связей транскрипционного профиля бластоцисты с клинико-анамнестическими данными супружеской пары: так, при поликистозе яичников выявлены изменения уровня экспрессии генов, связанных с сигнальными путями стресса и регуляцией апоптоза. Выявлен повышенный уровень стресс-чувствительного гена ATF3, экспрессия которого ведет к увеличению концентрации белка p53 и запуску апоптотического процесса; тогда как для развивающегося эмбриона регуляция апоптоза имеет критическое значение для выживания и поддержания гомеостаза. Одновременно с повышением уровня экспрессии проапоптотического гена наблюдается снижение экспрессии антиапоптотического гена BCL2L10 и гена HSPA1A, вовлеченного в процесс дифференцировки клеток. В бластоцистах, полученных от пациентов с мужским бесплодием, обнаружены значительные отличия от контроля по представленности транскриптов, ключевых для морфогенеза и пролиферации: повышена экспрессия гена INHBA, кодирующего регулятор пролиферации стромальных клеток гонад; снижена экспрессия генов LEFTY1 и LEFTY2, кодирующих факторы предопределения лево-правосторонней оси. У бластоцист от супружеских пар с идиопатическим бесплодием наблюдается сниженный уровень экспрессии гена адгезии CDH9, участвующего в регуляции морфогенеза и задействованного во внутриклеточных сигнальных путях, а также медиатора клеточной миграции LAMA4, играющего важную роль в органогенезе. Таким образом, для каждого из трех диагнозов наблюдаются изменения транскриптома бластоцисты, способные оказать негативное влияние на развитие и имплантацию эмбриона в силу нарушения клеточной пролиферации, миграции и адгезии.
Роль мужского фактора в детерминировании транскрипционного профиля бластоцисты была подчеркнута в работе Denomme M.M. et al. [14]. В данном исследовании транскриптом бластоцист, полученных от 128 пар с мужским бесплодием (олигоастенотератозооспермия), сравнивали с транскриптомом контрольной группы (118 пар). Статистически значимые (p<0,05) различия в уровне экспрессии зафиксированы для 469 транскриптов, имеющих отношение к процессу клеточного метаболизма в целом. Частота самопроизвольных прерываний беременности в группе с мужским бесплодием составила 14,7% против 2,2% в группе контроля. При этом частота наступления беременности между группами не различалась.
На транскриптом бластоцисты человека также может оказывать влияние среда, в которой культивируется эмбрион до имплантации. В работе Kleijkers S.H. et al. [15] проведено сравнение транскриптомов эмбрионов, культивированных в течение 6 дней в средах HTF (human tubal fluid) и G5 PLUS, по 10 эмбрионов в каждой из двух групп. Эмбрионы из двух групп были сопоставлены друг с другом попарно для сравнения таким образом, чтобы качество бластоцист и использованный метод оплодотворения в паре совпадали, а возраст пациентки различался в пределах 2,8 года. Анализ транскриптомов проводился индивидуально для каждого эмбриона, с использованием РНК-амплификации и микрочипов Agilent. В результате эксперимента между группами обнаружили статистически значимые отличия по уровню экспрессии 951 гена (p<0,01). В группе G5 PLUS зафиксирована повышенная экспрессия генов окислительного фосфорилирования, регуляции перехода от G1-фазы к S-фазе в клеточном цикле и репликации ДНК. Необходимо отметить, что для данного исследования были использованы бластоцисты, не прошедшие отбор для последующего переноса пациенткам.
Таким образом, анализ транскриптома бластоцист может, наряду с преимплантационным генетическим скринингом, служить инструментом для оценки качества и селекции бластоцист.
Транскриптом бластоцисты как маркер успешной имплантации
Впервые оценка связи между наступлением и исходом беременности и транскрипционным профилем бластоцисты была выполнена в эксперименте на быках в 2006 г. [16]. По результатам данной работы, сопоставление групп с отсутствием беременности или резорбцией эмбриона с контрольной группой, где родился теленок, выявило отличия в экспрессии 52 и 58 генов соответственно. В группе с наступившей беременностью и ее успешным разрешением наблюдалась экспрессия генов COX2 и CDX2, связанных с имплантацией, а также генов фактора роста BMP15, гена сериновой протеазы PLAU, участвующей в деградации внеклеточного матрикса, и плацента-ассоциированного белка 8 типа PLAC8. В случае с резорбцией эмбриона обнаружена дифференциальная экспрессия генов PLAC8, OCLN, PGK1 и AKR1B1. В группе с ненаступлением беременности выявлены отличия в экспрессии транскриптов TNFα, EEF1A1, MSX1, PTTG1, PGK1, AKR1B1 и CD9. Этой же группой исследователей данный эксперимент был воспроизведен на эмбрионах, полученных in vivo [17]. Биопсия бластоцист была проведена на 7-й день после инсеминации. Показано, что для полученных in vivo эмбрионов в случаях с ненаступлением беременности и с потерей беременности транскрипционные профили схожи. Выявлен 21 ген, уровень экспрессии которых отличен в группе с рожденным теленком, по сравнению с группами с ненаступлением и с потерей беременности как для in vivo, так и для in vitro полученных эмбрионов.
В другом эксперименте на животных (мыши линии BDF1) сопоставляли результаты анализа экспрессии генов в клетках трофэктодермы бластоцист и исходов переноса эмбриона в полость матки. Выявлено, что в неимплантировавшихся бластоцистах снижен уровень экспрессии генов B3gnt5 и Eomes, а в бластоцистах, перенос которых завершился самопроизвольным прерыванием беременности, снижена экспрессия генов Wnt3a и Eomes [18, 19].
Взаимосвязь между экспрессией генов и клиническим исходом переноса эмбрионов человека в полость матки мало изучена по причине ограниченного доступа к биологическому материалу. Биопсия клеток трофэктодермы бластоцисты человека, согласно опубликованным данным, не оказывает влияния на дальнейшее развитие эмбриона и используется для преимплантационной генетической диагностики [19–21]. Исследование транскриптома бластоцист человека с последующим переносом этих бластоцист в полость матки впервые было выполнено в 2008 г. Jones G.M. et al. исследовали транскриптом клеток трофэктодермы бластоцист человека, отобранных на 5-й день культивирования, и сопоставили эти данные с результатами переноса бластоцист [22]. Перенос бластоцист проводили спустя сутки после биопсии, на 6-й день культивирования. Переносили от 1 до 4 бластоцист, а для идентификации бластоцист, перенос которых привел к рождению ребенка, использовали метод генетической дактилоскопии. После переноса 149 бластоцист, подвергнутых биопсии, родились 37 здоровых детей. По результатам анализа биоптатов трофэктодермы бластоцист с применением ДНК-микрочипов были выявлены 44 947 транскриптов; из них 7317 транскриптов обнаружены исключительно в бластоцистах, перенос которых привел к беременности, и 1896 транскриптов – исключительно в неимплантировавшихся бластоцистах. Среди генов, экспрессируемых только в успешно имплантировавшихся бластоцистах, названы гены клеточной адгезии и коммуникации.
Группа ученых из Дании опубликовала в 2015 г. работу, посвященную анализу методом РНК-секвенирования транскриптома биоптата трофэктодермы бластоцист человека с последующим переносом единичного эмбриона и определением различий в уровне экспрессии генов между эмбрионами, перенос которых в полость матки привел к рождению ребенка, и неимплантировавшимися эмбрионами [23]. В исследовании участвовали пациентки моложе 38 лет без диагностированного эндометриоза. Биопсия осуществлялась на 5-й день культивирования, за сутки до переноса эмбрионов. В отличие от предыдущей работы, в данном исследовании «успешной» считалась бластоциста, перенос которой завершился рождением ребенка, а не только имплантацией. Ввиду очень ограниченного количества биологического материала, для сравнительной оценки уровня экспрессии был отобран только 181 ген, экспрессирующийся в каждом образце внутри группы с небольшим внутригрупповым разбросом в уровне экспрессии. Для 145 генов выявлен повышенный уровень экспрессии в неимплантировавшихся бластоцистах, остальные 36 генов продемонстрировали повышенную экспрессию в имплантировавшихся эмбрионах. При этом только для 37 генов уровень экспрессии между группами различался статистически значимо (p<0,05). Около 17% транскриптов, представленных в биоптатах «успешных» бластоцист, относятся к некодирующей РНК. Перечень выявленных транскриптов приведен в публикации [23].
В исследовании Ntostis P. et al. [24] в рамках программы ВРТ участвовали пять пациенток, которым в полость матки в сумме было перенесено восемь бластоцист. При этом в трех случаях из пяти перенос бластоцист привел к наступлению беременности. С применением РНК-секвенирования выявлено 47 транскриптов генов, дифференциально экспрессированных в успешно имплантировавшихся бластоцистах и в бластоцистах, перенос которых не привел к наступлению беременности. Из этого числа транскриптов в группе с неуспешной имплантацией в 36 случаях наблюдалась сниженная экспрессия соответствующих генов, а в остальных 11 – повышенная экспрессия генов. В неимплантировавшихся бластоцистах зарегистрирован сниженный уровень экспрессии генов DHCR7, HSD17B1 и CYP11A1, участвующих в биосинтезе стероидов, и повышенный уровень экспрессии гена BAK1, кодирующего проапоптотический фермент. При этом экспрессия гена KHDC1P1, функции которого пока не ясны, детектирована в клетках трофэктодермы всех неудачных бластоцист и практически отсутствует у имплантировавшихся бластоцист. Перечень выявленных транскриптов – потенциальных маркеров успешной имплантации приведен в публикации [24].
Исследования по изучению транскриптома бластоцисты человека были начаты не так давно и публикуются нечасто в связи с технической сложностью такого анализа, высокой ценностью биологического материала, а также с этическим аспектом. Однако проведенные в последнее десятилетие исследования показывают, что биопсия трофэктодермы бластоцисты с последующим анализом транскриптома может быть инструментом для исчерпывающей оценки имплантационного потенциала бластоцист, что позволит перейти к селективному переносу единственного эмбриона в ходе ЭКО.
