Преждевременные роды (ПР) как модель несостоявшегося взаимодействия в системе мать–плацента–плод, несомненно, имеют в основе своего патогенеза структурные и функциональные изменения на тканевом и молекулярном уровнях. Несмотря на достаточно большое внимание к проблеме ПР, морфологический аспект недонашивания изучен крайне мало. Научные поиски осложняются неоднозначностью клинических фенотипов ПР, среди которых выделяют преждевременный разрыв плодных оболочек (ПРПО) и спонтанное начало родов при целом плодном пузыре.
Ранее проведенные исследования указывают на значимую роль инфекции в патогенезе ПР, что подтверждается результатами патоморфологического исследования последов и клиническими исходами у недоношенных новорожденных [1, 2]. Тем не менее плацента у пациенток, родивших преждевременно, не всегда имеет признаки инфицирования, что объясняет необходимость поиска других причин ПР [3]. Работы, посвященные качественным изменениям структуры плодных мембран, крайне ограничены и представлены на пациентках с доношенной беременностью [4, 5]. Дальнейший поиск патоморфологических основ недонашивания крайне важен с позиции профилактики ПР. Исследования в данном направлении следует проводить с учетом клинических вариантов начала родовой деятельности.
Цель исследования – изучить особенности морфофункционального состояния последа, включая показатели метаболизма коллагена в плодных оболочках, при различных клинических фенотипах спонтанных ПР (спонтанное начало родовой деятельности и ПРПО).
Материалы и методы
В проспективное исследование, проведенное в КГБУЗ «Алтайский краевой клинический перинатальный центр» в период с 2018 по 2020 гг., включены 93 пациентки со спонтанными ПР в сроке 28–33,6 недели. В зависимости от клинического варианта начала родов в когорте исследуемых сформировано две группы: I группа – 71 пациентка с ПРПО и отсроченным началом родовой деятельности; II группа – 22 женщины со спонтанным началом ПР при целом плодном пузыре. Критериями исключения из исследования явились пациентки с многоплодной беременностью, наличием пороков развития плода, некомпенсированными соматическими заболеваниями и тяжелыми акушерскими осложнениями. Обязательным условием для включения в исследование явилась своевременная постановка беременной на учет для полноты сведений о течении беременности. У всех родильниц проведено макро- и микроскопическое исследование последа, а также определение метаболизма коллагена в плодных оболочках методом иммуногистохимии (ИГХ). Коллагеновая сеть плодных мембран представлена в основном коллагеном I и III типов. Для коллагена III типа маркеров синтеза и деградации не существует. В связи с чем в качестве маркера синтеза коллагена использовали пропептид проколлагена I типа (PICP), а маркера деградации – карбокситерминальный телопептид коллагена I типа (СITP). Накоплен достаточно большой опыт использования этих молекул в диагностике заболеваний соединительной ткани [6]. Для патоморфологического исследования брали 6 кусочков: пуповину в плодной и материнской части, плодные оболочки плаценты – края разрыва в виде ленты, скрученные в виде роллов, второй ролл, вырезанный у края плацентарного диска, фрагмент децидуальной пластины с ворсинами и фрагмент хориальной пластины с ворсинами. После стандартной гистологической проводки в автоматическом режиме на аппарате Thermo Scientific Excelsior AS (США) на полуавтоматическом микротоме получали срезы толщиной 5–7 мкн. Полученные срезы для обзорной окраски окрашивали по стандартной методике гематоксилин-эозином. Для иммуногистохимического (ИГХ) исследования пероксидазным методом срезы одновременно депарафинировались с демаскировкой антигена в установке для ИГХ-окрашивания препаратов Autostainer (Thermo Fisher Scientific Inc. (США)) с последующей обработкой первичными антителами. Использовались кроличьи поликлональные антитела к коллагену I типа и мышиные поликлональные антитела к PICP и CITP фирмы CLOUD-CLONE CORP (USA). Для визуализации использовали системы детекции UltraVision Quanto Detection System HRP DAB. Методом обзорной микроскопии проводилась оценка зрелости ворсинчатого хориона и соответствия сроку гестации, состояния межворсинчатого пространства, выраженности компенсаторно-приспособительных и адаптационных реакций, стромально-сосудистых поражений (тромбозы, хорангиоматоз, плодная и материнская мальперфузия), иммуновоспалительных процессов с определением пути инфицирования. Микрофотографии получали с помощью системы фиксации микроскопических изображений: микроскопа AxioLab (Carl Zeiss Jena, Germany) с использованием цифровой фотокамеры (Carl Zeiss Jena, Germany), на увеличении ×400, ×100, анализировались не менее 10 полей. При последующем анализе микрофотографий выбирали случайные поля зрения (не менее 12 полей для каждого образца без дефектов и артефактов), которые обрабатывали в программе Rawtherapee для нормализации баланса белого и экспозиции. Полученные микрофотографии использовались для количественной оценки содержания белков коллагена I типа, PICP и CITP с применением программы Morphostain для морфометрического анализа пятен, основанной на методе деконволюции цвета, подсчитывалась окрашенная область с DAB-хромагеном, используя типичные протоколы ИГХ. После анализа измерялась разница содержания белков в тестируемых образцах.
Исследование было одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России. Все пациентки включены в исследование с их добровольного информированного согласия.
Статистический анализ
Статистическая обработка полученных данных осуществлялась при помощи программного обеспечения IBM SPSS Statistics 23,0. Оценка распределения количественных показателей проводилась с помощью критерия Шапиро–Уилка, исходя из численности II группы (n=22) и показателей эксцесса и асимметрии. Распределение количественных показателей отличалось от нормального. Их значения представлены в виде медианы и интерквартильного размаха: Ме (Q1;Q3). Для сравнения количественных переменных использовался критерий Манна–Уитни. Качественные переменные представлены в виде абсолютных и относительных значений в формате n (%), для их сравнения использовался критерий хи-квадрат (χ2) Пирсона. Зависимость бинарных показателей (вероятности исхода) от количественных и качественных показателей оценивалась с помощью бинарной логистической регрессии. Для оценки зависимости временного фактора от наличия исхода применялся метод Каплана–Мейера. Статистически значимыми считались отклонения при p<0,05.
Результаты
Медиана возраста родильниц I группы составила 29,0 (27,5;30,2) года, II группы – 27,0 (24,9;30,3) лет (p>0,05). Сроки родоразрешения были сопоставимы: 32,1 (29,6;31,5) недели у пациенток с ПРПО и 32,5 (30,5;32,4) недели у женщин со спонтанным началом родов (p>0,05). Длительность безводного периода у родильниц I группы составила 107,9 (79,9;135,9) ч.
В ходе макроскопического исследования последа установлено, что средняя масса плаценты и плацентарно-плодный коэффициент (ППК) в группах сравнения не отличались и соответствовали нормативам для срока гестации. Масса плаценты у пациентов с ПРПО составила 360 (348,9;383,6) г, ППК – 0,25 (0,23;0,27), у пациентов II группы– 380 (344,6; 459,9) г, при аналогичном ППК – 0,25 (0,21; 0,25). У 48/71 (67,6%) пациенток I группы и 11/22 (50%) II группы отмечался рассыпной тип кровоснабжения плаценты (p>0,05). Аномалии прикрепления пуповины (краевое, оболочечное) встречались у пациенток I и II групп одинаково часто: у 5/71 (7%) и 1/22 (4,5%) родильниц соответственно, так же, как и аномалии развития плаценты (плацента, окруженная ободком или валиком, двухдолевая плацента, гипоплазия плаценты) – у 9/71 (12,7%) и 4/22 (18,2%) пациентов соответственно (p>0,05). Данные микроскопии плаценты представлены в таблице 1.
При морфологическом исследовании плацент более чем у половины исследуемых были выявлены нарушения дифференцировки ворсин как по типу ускоренного, так и по типу замедленного созревания. Обнаружены признаки недостаточности материнского или плодного кровотока с формированием афункциональных зон. Оценка инволютивно-дистрофических процессов не выявила значимых отличий между удельным объемом кальцинатов и участков тромбоза межворсинчатого пространства между группами. Функциональное состояние плацентарного комплекса было оценено как хроническая субкомпенсированная плацентарная недостаточность у 63/71 (88,7%) пациенток I группы и у 19/22 (86,4%) родильниц II группы (p>0,05). В остальных случаях получено заключение о наличии декомпенсированной плацентарной недостаточности. Компенсаторно-приспособительные реакции у 57/71 пациенток I группы (80,3%) оценены как слабые, у 12/71 (16,9%) – умеренные. Во II группе женщин слабые компенсаторно-приспособительные реакции встречались у 15/22 (68,1%) пациенток, умеренные – у 6/22 (27,3%). Статистических различий по степени компенсаторных реакций между сравниваемыми группами не было. Признаки инфицирования последа, причем за счет восходящего пути инфицирования, значимо чаще наблюдались у пациенток с ПРПО, чем у родильниц II группы – 55/71 (77,5%) и 11/22 (50%) случаев соответственно, что является известным фактом. В последах родильниц с ПРПО чаще, чем во II группе, обнаруживался фуникулит – у 18/71 (25,4%) и 1/22 (4,5%) исследуемых соответственно (p=0,03), который во всех случаях сочетался с мембранитом, что подтверждает восходящий путь инфицирования. Cтадия воспалительного ответа плода характеризовалась как первая у 3/19 (15,8%) пациенток, как вторая – у 5/19 (26,3%) обследованных, у 11/19 (57,9%) – как третья [7]. Воспалительные изменения, характерные для гематогенного пути развития, встречались одинаково часто.
Для оценки вероятности развития фуникулита от наличия известных факторов инфекционного риска, таких как истмико-цервикальная недостаточность, хронические инфекционные заболевания у матери (инфекционные заболевания мочевых и дыхательных путей), нарушение микробиоценоза влагалища (вагиниты, бактериальный вагиноз), острые инфекции иной локализации у матери при беременности (острые респираторные заболевания, гестационный пиелонефрит), а также от фактора длительности безводного периода применялся метод бинарной логистической регрессии. Для построения модели использовался метод пошагового исключения. Результаты на этапе включения в анализ исследуемых факторов представлены в таблице 2.
В результате пошагового исключения в модель логистической регрессии был включен только фактор длительности безводного периода. Зависимость развития фуникулита от длительности безводного периода описывалась уравнением:
p=1/(1+e-z)× 100%, z=-2,05+0,005×Xб/п,
где p – вероятность наличия фуникулита, Хб/п – длительность безводного периода (ч). Модель является статистически значимой (р=0,008), однако исходя из коэффициента детерминации (R=0,116), включает лишь 12% факторов, определяющих вероятность исхода, и обладает низкой чувствительностью (11,6%), поэтому не может быть использована в практической деятельности. Для совершенствования модели требуются дальнейшие поиски прогностических критериев.
Анализ, проведенный методом Каплана–Майера среди пациенток I группы, имевших длительный безводный период, показал, что медиана длительности латентного периода при последующей верификации фуникулита составила 350,0±51,1 ч (95% ДИ 309,8–540,9), что с клинических позиций соответствует времени завершения антибактериальной терапии при выжидательной тактике у пациенток с ПРПО (рис. 1). Курс антибактериальной терапии в зависимости от выбранной схемы лечения составлял 7–10 суток.
У пациенток с длительностью безводного периода до 168 ч фуникулит выявлен у 9/44 пациенток (20,2%); среди исследуемых с длительностью латентного периода 168–336 суток – у 4/18 пациенток (22,2%); при длительности безводного периода более 336 ч фуникулит был обнаружен у 5/9 пациенток (55,5%) (p=0,001). Полученные результаты позволяют предположить, что большая частота воспалительных изменений последа у пациенток основной группы связана с восходящим инфицированием на фоне длительного безводного периода, а не с первоначальным инфекционным поражением плодных оболочек с исходом в ПРПО.
Поиски качественных изменений структуры плодных мембран, а именно метаболизма коллагена показали, что в плодных оболочках родильниц основной группы определялось значимое снижение содержания PICP – пропептида, участвующего в процессе синтеза коллагена, что сопровождалось снижением количества коллагена I типа. Значимость различий в экспрессии коллагена I типа близка к критической (p=0,054). Различий в содержании маркера деградации коллагена – CITP у пациенток со спонтанным началом родов и беременных с ПРПО не выявлено. Распределение площади окрашивания антителами к PICP, коллагену I типа и CITP представлено на диаграммах рисунка 2.
На микрофотографиях плодных оболочек с места разрыва, окрашенных антителом к PICP (рис. 3), отмечается более слабое окрашивание у пациентки I группы по сравнению с пациенткой II группы.
Полученные данные демонстрируют роль патологии структуры плодных мембран на уровне процессов коллагенообразования как возможного патогенетического звена ПРПО.
Обсуждение
Анализ литературы показал, что в качестве основной причины недонашивания в литературе рассматривается инфекционный фактор. Частота инфекционно-воспалительных изменений последа в структуре обследованных нами пациенток совпадает с большинством предложенных ранее данных [8–10]. Ключевым вопросом практического акушерства является время безводного периода до развития хориоамнионита. Знания в этом отношении позволяют оптимизировать выжидательную тактику при недоношенном сроке гестации. В исследовании Park et al. было обследовано 156 пациенток с ПРПО при недоношенной беременности. На момент разрыва плодных мембран пациентки не имели признаков интраамниотической инфекции, что было подтверждено данными лабораторного и бактериологического исследования околоплодных вод, полученных при амниоцентезе [11]. У пациенток с ПРПО и последующей гистологической верификацией хориоамнионита медиана времени безводного периода составила 131,3 ч, что меньше, чем в нашем случае (350±51,1 ч); однако в исследовании не указано, проводилась ли пациенткам антибактериальная терапия при выжидательной тактике. Иные исследования гистологической верификации оптимального безводного периода нами не были найдены. Данные о структурных изменениях плодных оболочек при преждевременном излитии околоплодных вод при доношенной беременности проведены Болотских Н.М. [5]. Согласно данным автора, в патогенезе ПРПО в доношенном сроке беременности играют значительную роль активация матриксной металлопротеиназы 1 типа и снижение активности ее ингибитора, что приводит к разрушению коллагена и разрыву плодной мембраны. В исследовании Сухих Г.Т. и соавт. в качестве индукторов коллагенолиза при доношенной беременности, кроме металлопротеиназы 1 типа, доказана роль матриксной металлопротеиназы 9 типа [4]. То есть большинство научных источников говорят о преобладании процессов деградации коллагена у пациенток с преждевременным излитием околоплодных вод. Однако все они проведены у беременных в доношенном сроке. В нашем исследовании изучен механизм ПРПО при недоношенной беременности, где в процесс, возможно, вовлечены иные механизмы, и преобладает гипотеза изначально неполноценной мембраны.
Заключение
Таким образом, проведенное исследование демонстрирует, что различные варианты спонтанных ПР имеют в своей основе различные патогенетические механизмы. Ключевым звеном в недонашивании при всех вариантах ПР является хроническая плацентарная дисфункция, которая в 50% случаев ассоциирована с инфекцией. В случае ПРПО имеет значение исходная структурная патология плодных мембран, способствующая их преждевременному разрыву. Данная проблема требует подробного изучения для профилактики ПР.
