Наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) — распространенное гинекологическое заболевание, при котором клетки эндометрия (внутреннего слоя стенки матки) разрастаются за пределами матки. Участие иммунной системы в патогенезе эндометриоза считается установленным [1–4]. К иммунным нарушениям при эндометриозе относят снижение реакций клеточной цитотоксичности в отношении клеток аутологичного эндометрия и развитие аутоиммунных реакций [5–8]. Для эндометриоза характерно развитие локального воспаления с системной субклинической манифестацией [9–12].
Для более полного понимания патогенеза НГЭ представляется важным изучение роли ангиогенных, нейрогенных, лимфоангиогенных факторов, цитокинов, хемокинов, различных ростовых факторов в формировании и прогрессировании очагов НГЭ. Исследование механизмов патогенеза и поиск диагностических маркеров НГЭ необходимы для разработки ранней неинвазивной диагностики и патогенетической терапии данного заболевания.
Самым распространенным материалом для изучения патогенеза развития НГЭ является перитонеальная жидкость, которую используют для изучения фенотипа и функционального состояния перитонеальных макрофагов, содержания цитокинов, хемокинов, различных ростовых факторов [13–17]. Однако получение перитонеальной жидкости возможно только при инвазивных вмешательствах, что значительно ограничивает возможности исследования.
Поэтому изучение патогенеза эндометриоза часто проводится с использованием экспериментальных моделей, в частности in vitro. В настоящее время уже создана иммортализованная линия эндометриоидных клеток человека KC02-44D, цитоскелет, экспрессия генов и биохимический фенотип которых сходны с таковыми у зародышевых эндометриальных стромальных клеток. Как предполагается, эта линия клеток может быть полезной в изучении эндометриальной функции и ассоциированных с ней патологий [18]. Описаны процедуры создания и поддержания первичных культур клеток поверхностного эпителия яичников, трубного эпителия и эндометрия человека, протоколы для иммортализации, клональной изоляции и сокультивирования со стромальными клетками, что может быть полезно для исследования молекулярной и клеточной функции этих видов эпителия в норме и при патологии [19].
Перспективным направлением представляется сравнительное исследование фенотипа и функциональной активности при культивировании in vitro клеток из эутопического эндометрия и очагов эндометриоза различной локализации [20, 21]. Целью настоящей работы являлась сравнительная оценка профиля секретируемых белков клетками из эндометриоидных очагов и эутопического эндометрия женщин с НГЭ в культуре in vitro.
Материал и методы
Образцы эутопического и эктопического эндометрия забирали во время малоинвазивных операций – лапароскопии в сочетании с гистероскопией у 21 пациентки с НГЭ, которые проходили стационарное лечение в отделении оперативной гинекологии и в хирургическом отделении ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (РФ). Всем женщинам диагноз НГЭ был поставлен интраоперационно и подтвержден гистологически. У 18 пациенток были взяты парные образцы эутопического эндометрия и эндометриоидных гетеротопий. Контрольные образцы эндометрия были взяты у 8 пациенток, прооперированных по поводу миомы матки (n=3), неполной и полной внутриматочной перегородки (n=4), кисты яичника (n=1). Отсутствие эндометриоза у этих пациенток было подтверждено во время оперативного вмешательства по поводу основного заболевания.
Возраст пациенток, включенных в исследование, варьировал от 25 до 40 лет. От каждой пациентки было получено информированное согласие на проведение данного исследования.
Образцы эутопического эндометрия и очагов эндометриоза помещали в стерильные пробирки и немедленно транспортировали в лабораторию. Образцы тканей промывали раствором фосфатно-солевого буфера, механически измельчали и затем инкубировали в 0,07% растворе коллагеназы IА (Sigma-Aldrich, США) при 37 °С в течение 30 минут. Смесь центрифугировали при 2000 об./мин в течение 5 минут, надосадочную жидкость удаляли и осадок ресуспендировали в среде DMEM/F-12 («ПанЭко», РФ), содержавшей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, Великобритания), 50 Ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина («ПанЭко», РФ).
Полученную клеточную суспензию переносили в культуральные флаконы площадью 25 см2, плотность посева составляла 35×103 ядросодержащих клеток на 1 см2.
Поверхностный фенотип клеток, взятых после первого пассажа, определяли с помощью стандартного набора моноклональных антител, меченных флуоресцеин-изотиоцианатом против антигенов CD90, CD26, CD34, фикоэритрином – против антигенов CD105, CD146, CD14, CD200, HLA-DR, аллофикоцианином – против антигенов CD73, CD45 (BD Bioscience, США). Анализ проводили с использованием проточного цитофлуориметра FACSСalibur (Becton Dickinson, США).
Культуральную среду меняли каждые 3 суток, пассирование культур осуществляли при достижении монослоя. Сбор кондиционированной среды для анализа растворимых факторов осуществляли во время второго пассажа при достижении в культуральном флаконе монослоя и центрифугировали при 2000 об./мин в течение 5 минут. Супернатант аликвотировали по 1 мл, замораживали при –20 °С, хранили до проведения исследования при –80°С.
В кондиционированной среде 2-го пассажа культур эктопического и эутопического эндометрия определяли содержание различных растворимых аналитов (интерлейкин (IL)-1β, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12(p70), IL-13, IL-15, IL-17A, интерферон (IFN) γ, фактор некроза опухоли (TNF) α, моноцитарный хемотаксический протеин (MCP) 1, макрофагальный белок воспаления (MIP) 1α, MIP-1β, IFN-γ индуцируемый протеин (IP)-10, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF)-bb, RANTES, Eotaxin, сосудисто-эндотелиальный фактор роста (VEGF), фактор роста фибробластов, основная форма (FGF basic)) мультиплексным методом с использованием стандартной 27-плексной тест-системы Bio-Plex Pro Human Cytokine 27-plex Assay (Bio-Rad, США) на проточном лазерном иммуноанализаторе Bio-Plex 200 (Bio-Rad, США) и последующей обработкой полученных результатов с использованием приложения Bio-Plex Manager 6,0 Properties (Bio-Rad, США). Концентрация аналитов рассчитывалась, исходя из продукции одним миллионом клеток в 1 мл культуральной среды (пг/мл/106 кл).
Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием пакета статистических программ для Microsoft Office Excel 2007 и с использованием программы MedCalc12 для Windows 7. Проверку гипотезы о нормальном распределении осуществляли, используя критерий Шапиро–Уилка. Поскольку распределение данных отличалось от нормального, для оценки различий в выборках применяли U-критерий Манна–Уитни, Данные в таблицах представлены как медиана (25– 75-й процентили) распределения. Различия считали значимыми при р>0,05.
Результаты
Клетки, выделенные из тканей эутопического эндометрия и эктопических очагов эндометриоза после второго пассажа, были гомогенными по морфологии и способности адгезии к пластику, их фенотип представлен в табл. 1.
Культивируемые клетки, выделенные из контрольного и эутопического эндометрия, фенотипически различались между собой только по содержанию CD90+-клеток. Доли клеток, экспрессирующих остальные исследованные маркеры, были практически равны. Фенотипическая характеристика клеточного состава культивируемых клеток, которые были выделены из очагов эндометриоза, значительно отличалась от таковой клеток и нормального, и эутопического эндометриоза. На клетках из очагов эндометриоза максимально были представлены CD90 и CD26 и минимально – маркеры CD105 и CD146. Во всех культурах было одинаковым количество CD73+-клеток. В каждой из культур было менее 2% клеток, позитивных по CD106, CD200, CD14, CD34, CD45, HLA-DR. Исходя из приведенных данных, можно заключить, что все исследованные клетки преимущественно принадлежали к популяции мезенхимальных стромальных клеток.
При исследовании белкового профиля супернатантов второго пассажа культур клеток, выделенных из эутопического эндометрия и эндометриоидных гетеротопий, определяли концентрации цитокинов (IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12(p70), IL-13, IL-15, IL-17A, IFN-γ, TNFα), хемокинов (IL-8, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, IP-10, RANTES, Eotaxin) и ростовых факторов (IL-7, IL-9, CSF, GM-CSF, PDGF-bb, VEGF, FGF basic). Результаты оценки продукции исследованных аналитов в супернатантах культур эутопического эндометрия пациенток контрольной группы представлены в табл. 2.
Обращает на себя внимание высокая продукция клетками культуры IL-6, хемокинов IL-8 и MCP-1, а также VEGF.
Результаты анализа профиля изученных белков в супернатантах клеток эутопического эндометрия пациенток с НГЭ по сравнению с профилем белков в супернатантах клеток эндометрия пациенток контрольной группы представлены на рис. 1.
Как следует из данных, представленных на рис. 1, концентрация факторов роста и хемокинов в супернатантах культур клеток эутопического эндометрия и клеток контрольного эндометрия не отличались. При исследовании уровня цитокинов обнаружена увеличенная продукция клетками эутопического эндометрия TNF-α (Me 102, 38–206 и Me 36, 29–71, соответственно, р=0,042) и IL-4 (Me 6,9, 3,5–12,9 и Me 2,9, 2,7–5,0 соответственно, p=0,033).
Результаты анализа профиля растворимых белков в супернатантах культур клеток из очагов эндометриоза пациенток с НГЭ, по сравнению с их профилем в супернатантах клеток контрольного эндометрия, представлены на рис. 2.
Как следует из данных, представленных на рис. 2, в супернатантах культур клеток из очагов эндометриоза концентрация всех исследованных белков значительно превышает контрольные значения, при этом концентрация IL-6 выше в 213 раз, хемокина Eotaxin –в 65 раз, хемокина MCP-1 – в 50 раз, ростового фактора G-CSF – в 66 раз.
Сравнительный анализ концентрации исследованных белков в супернатантах культур клеток из эндометриоидных гетеротопий и эутопического эндометрия пациенток с НГЭ с использованием парного критерия Вилкоксона для зависимых выборок представлен на рис. 3.
Как можно заключить из представленных на рис. 3 данных, концентрация исследованных цитокинов существенно выше в супернатантах культур клеток из эндометриоидных гетеротопий (IL-6 – в 42,3 раза). Концентрация хемокинов также была выше (MIP-1b – в 36 раз), но отсутствовали различия в концентрации IP-10 и RANTES. Также существенно выше была концентрация факторов роста, особенно VEGF, но отсутствовали различия в концентрации G-CSF, GM-CSF, PDGF-bb.
Обсуждение
В нашем исследовании получены и проанализированы культуры клеток из образцов тканей нормального и эутопического эндометрия, а также очагов эндометриоза. Как следует из представленных данных, большинство клеток, культивированных до второго пассажа, по своему фенотипу относились к популяции клеток мезенхимального происхождения. Для выделенных клеток были характерны хорошая адгезия к поверхности культурального пластика, фибробластоподобная форма и экспрессия антигенов CD90, CD26, CD73, CD105 в сочетании с отсутствием CD45, CD34, CD14, что используется для идентификации мезенхимальных стромальных клеток (МСК) [22, 23]. Это позволило сделать вывод о том, что в культурах второго пассажа преобладали стромальные клетки. Наши результаты согласуются с данными Uder C. [24], которые для идентификации МСК использовали сходную панель клеточных поверхностных маркеров (CD105+, CD73+, CD90+, CD34-, CD14-).
В работе Chan et al. [19] при анализе цитокиновой продукции in vitro стромальными клетками, выделенными из аналогичных тканевых образцов ткани пациенток с эндометриозом яичников, показано, что для клеток не только из очагов эндометриоза, но и из эутопического эндометрия, характерны отличающееся от клеток из контрольного эндометрия пролиферативное поведение, инвазивность и способность к адгезии.
Эндометриоз ассоциируется с нарушением экспрессии многих растворимых факторов: молекул адгезии, ростовых факторов, цитокинов, матриксных металлопротеиназ и ферментов синтеза и метаболизма эстрогенов [25]. В систематическом обзоре 2014 г. указывается, что, по заключениям ряда исследований, хемокины и их рецепторы предлагается рассматривать в качестве потенциальных биомаркеров эндометриоза, особенно IL-8 или CXCL8 (в 51,6% проанализированных работ), MCP-1 или CCL-2 (в 38,7% работ), RANTES или CCL5 (в 19,3% работ) [26]. Поскольку известно, что уровни IL-8 увеличиваются при любых воспалительных процессах, то они, скорее, являются биомаркерами воспалительного процесса, что подтверждает роль воспаления в патогенезе эндометриоза.
Немалое количество работ последних 5 лет посвящено анализу содержания цитокинов в сыворотке крови пациенток с эндометриозом разными методами, в том числе и мультиплексным. Обнаружено повышенное содержание IL-1, IL-6 [27–29]. По мнению одних исследователей, маркерным для данной патологии может быть повышенный уровень противовоспалительных цитокинов IL-1Ra, IL-4 и IL-10 [30], по мнению других – повышенный уровень ключевых провоспалительных цитокинов IL1β, IL-6, и TNF-α [31].
Анализ содержания ряда (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IFN-γ, TNF и VEGF-A) цитокинов в перитонеальной жидкости пациенток с эндометриозом выявил ассоциацию с наличием эндометриоза повышенного уровня IL-6 и IL-8 [32], повышенного уровня IL-6, IL-18, эотаксина и MCP-1, независимо от фазы менструального цикла [33], повышенного уровня IL-6 и трансформирующего ростового фактора (TGF)-β, но без различий с контролем в содержании IL-10 и IL-17.
В эксперименте in vitro было показано, что IL-17 увеличивает секрецию IL-8 эндометриоидными стромальными клетками и тем самым стимулирует появление очагов эндометриоза [32]. IL-17A – важный ангиогенный и провоспалительный цитокин, вовлекаемый в патофизиологию хронических воспалительных заболеваний. Иммуногистохимически определена локализация IL-17A в строме образцов эутопического эндометрия и из эндометриоидных очагов и показана различная экспрессия его в этих типах тканей. Стимуляция in vitro эндометриальных стромальных клеток, клеток Ishikawa и HUVEC этим цитокином приводила к значительному увеличению ангиогенных VEGF и IL-8, провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-1β, хемокинов G-CSF, CXCL12, CXCL1 и CX3CL1. Поскольку хирургическое удаление эктопических очагов приводило к резкому снижению системного уровня данного цитокина, авторы делают вывод о том, что эндометриоидные очаги продуцируют IL-17A, и IL-17A играет важную роль в обеспечении ангиогенного и провоспалительного окружения в брюшной полости при возникновении и поддержании эктопических очагов [33, 34].
В эксперименте с культивированием макрофагов, выделенных из перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом и стимулированных in vitro липополисахаридом, обнаружен одинаковый с контролем уровень секреции макрофагами IL-1β при повышенном уровне его в перитонеальной жидкости пациенток. Был сделан вывод о том, что нарушение в уровне продукции цитокинов семейства IL-1 является важным патогенетическим фактором в развитии эндометриоза. Этот вывод подкрепляется экспериментом, в котором показано, что IL-1β, стимулирующий катаболизм триптофана, через увеличение экспрессии триптофан-2,3-диоксигеназы усиливает продукцию IL-6 and IL-8 эндометриальными стромальными клетками [32]. Важная роль IL-1β в патогенезе эндометриоза также подтверждается результатами исследования, в котором изучали влияние IL-1β на секрецию VEGF стромальными клетками из очагов эндометриоза [33]. Обнаружено, что добавление IL-1β в культуру стромальных клеток из эндометриоидных очагов и из эутопического эндометрия увеличивало освобождение VEGF в обоих типах культур, равно как и в контроле, через увеличение экспрессии циклооксигеназы-2 – фермента, который экспрессируется макрофагами, фибробластами и эндотелиальными клетками, индуцируется цитокинами или факторами роста при воспалении.
При проведении мультиплексного анализа аналитов супернатантов культур второго пассажа нами был выявлен различный уровень продукции in vitro большого спектра исследованных белков клетками из эутопического эндометрия и очагов эндометриоза при сравнении с контролем (см. рис. 1–3). Обнаружено, что продукция белков клетками из эутопического эндометрия отличалась от контроля более высоким уровнем TNF-α и IL-4 (цитокинов, отражающих процессы клеточной активации), но не имела отличий по продукции хемокинов и ростовых факторов, характеризующих соответственно межклеточное взаимодействие и пролиферативную активность. Функциональное состояние in vitro клеток, выделенных из эктопических очагов пациенток с НГЭ, существенно отличалось от клеток и нормального, и эутопического эндометрия по продукции всех исследованных цитокинов, хемокинов и ростовых факторов (см. рис. 2, 3). Наиболее значительным превышение концентрации было у IL-6, эотаксина, хемокина MCP-1 и ростовых факторов G-CSF и VEGF.
Заключение
Исходя из изложенного, полученные нами результаты исследования продукции in vitro широкого спектра белков, характеризующих функциональное состояние стромальных клеток, выделенных из эутопического эндометрия и эктопических очагов эндометриоза, согласуются с уже опубликованными данными и указывают на состояние повышенной активации клеток из эктопических очагов, продуцирующих в культуральную среду цитокины различной функциональной направленности, хемокины и ростовые факторы. Совокупность данных литературы и полученных нами результатов свидетельствует о значительном вкладе в патогенез эндометриоза растворимых факторов, опосредующих разные аспекты клеточных взаимодействий, способствующих воспалительному процессу, ангиогенезу и пролиферации клеток. Однако очевидная сложность патогенетических механизмов развития НГЭ диктует необходимость дальнейших исследований, в частности роли цитокинов и ростовых факторов во взаимодействии эпителиальных и стромальных клеток при эндометриозе.
