Период менопаузального перехода (МП) независимо от хронологического старения ассоциирован с неблагоприятными изменениями липидного профиля, которые повышают у женщин риск развития сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) [1, 2].
По данным исследования SWAN (Study of Women’s Health Across the Nation), у женщин за год до и в течение года после последней менструации отмечается значительное увеличение уровней общего холестерина (ХС), холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС-ЛПНП) и аполипопротеина В [1, 3]. Выраженность атеросклеротических изменений сонных артерий в постменопаузе пропорциональна повышению атерогенности липидного спектра крови в период МП [3]. Ремоделирование сосудов происходит уже на этапе МП, в его поздней фазе отмечается значительное увеличение толщины комплекса интима-медиа и диаметра сонных артерий по сравнению с ранней фазой МП и пременопаузой [1].
Менопауза ассоциирована с изменением ключевой антиатерогенной функции липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) – обратным транспортом ХС из периферических тканей в печень, что приводит к снижению протективных свойств ЛПВП: более высокий уровень ЛПВП, ассоциированный в пременопаузе с менее выраженным атеросклерозом сосудов, в постменопаузе связан с более выраженным атеросклеротическим поражением [1].
В период МП у женщин отмечается повышение уровней артериального давления (АД), глюкозы, инсулина, триглицеридов (ТГ), что обусловлено преимущественно хронологическим старением [1, 3]. Однако при этом наблюдается увеличение распространенности и тяжести метаболического синдрома (рост числа его компонентов), ассоциированное с МП и не зависящее от возраста [1, 3].
Таким образом, МП – период формирования факторов риска кардиометаболических заболеваний, и для изучения лежащих в их основе патофизиологических процессов необходимо использовать все доступные современные методы. Исследование липидного профиля с помощью масс-спектрометрии, позволяющее получить информацию о сотнях липидов, несет в себе большой потенциал для расширения превентивных и терапевтических возможностей в отношении заболеваний, связанных с менопаузой [4]. Липиды, являясь компонентами клеточных мембран и выполняя роль вторичных мессенджеров, задействованы практически во всех процессах, происходящих в организме человека [4]. К настоящему времени описана роль различных липидов в качестве биомаркеров преэклампсии, рака шейки матки, ожирения, атеросклероза, инсулинорезистентности (ИР), воспаления, сахарного диабета 2 типа (СД 2 типа), ССЗ и нейродегенеративных заболеваний [4–7].
Целью данного исследования является комплексная оценка метаболического профиля у женщин в ранней и поздней фазах МП с помощью традиционных биохимических методов, высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС), изучения композиционного состава тела, что позволит расширить представление о метаболических нарушениях и их роли в развитии кардиометаболических заболеваний.
Материалы и методы
Проведено обсервационное одноцентровое одномоментное исследование с участием 125 женщин в возрасте 42–52 лет в период МП (стадия репродуктивного старения -2; -1 по STRAW +10 [1]), обратившихся в отделение гинекологической эндокринологии ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» МЗ РФ. Критериями невключения являлись: дефицит массы тела (индекс массы тела (ИМТ) менее 18,5 кг/м²), ожирение (ИМТ больше или равен 30 кг/м²), беременность, период грудного вскармливания, тяжелые соматические заболевания, терапия препаратами, содержащими половые гормоны или влияющими на обмен веществ, менее чем за 6 месяцев до начала исследования; синдром поликистозных яичников в анамнезе.
Исследование было одобрено локальным Этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» МЗ РФ. Перед включением в исследование пациенты подписывали информированное добровольное согласие.
Проводились измерение антропометрических параметров – массы тела, роста, окружности талии (ОТ) и расчет ИМТ по формуле вес (кг)/рост2 (м). Оценка композиционного состава тела проводилась с помощью двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (ДЭРА) на аппарате Lunar model 8743 (GE Medical Systems, США) с использованием программы CoreScan (GE Healthcare, США) [8].
Измерение АД проводили с помощью автоматического тонометра (Omron M2 Basic, Japan) и определяли как среднее значение двух измерений.
Образцы крови участников исследования были взяты натощак после ночного голодания на 2–
4-й день менструального цикла. Определение концентрации половых гормонов в сыворотке крови (фолликулостимулирующего (ФСГ), эстрадиола, общего тестостерона), глобулина, связывающего половые гормоны (ГСПГ), и инсулина выполнялось электрохемилюминесцентным методом на автоматическом иммунохимическом анализаторе Cobas е411 (Roche Diagnostics GmbH, Германия). Индекс свободного тестостерона (ИСТ) рассчитывали по формуле:
Уровень лептина и адипонектина определяли в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа с помощью коммерческих наборов DBC (Канада) и Mediagnost (Германия) соответственно. Концентрацию С-реактивного белка (СРБ) определяли иммунотурбидиметрическим высокочувствительным методом.
Уровни общего ХС, ТГ, ХС-ЛПНП, ХС-ЛПВП, аполипопротеина А1, аполипопротеина В, мочевой кислоты в сыворотке крови и глюкозы, гликированного гемоглобина (HbA1c) в плазме крови определяли стандартными биохимическими методами. Расчет коэффициента атерогенности (КА) производили по формуле:
Для оценки чувствительности к инсулину проводили расчет индекса ИР HOMA по формуле:
Значение индекса HOMA≥2,7 являлось критерием ИР [9]. Наличие метаболического синдрома (МС) у пациенток определяли на основании критериев IDF 2006 г.: наличие абдоминального ожирения (ОТ≥80 см) и двух из следующих признаков: ТГ≥1,7 ммоль/л, ХС-ЛПВП<1,29 ммоль/л (или терапия дислипидемии), систолическое АД ≥130 мм рт. ст./диастолическое АД ≥85 мм рт. ст. (или антигипертензивная терапия), уровень глюкозы плазмы крови натощак ≥5,6 ммоль/л [10].
Анализ липидного состава образцов сыворотки крови осуществляли с помощью хроматомасс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией на жидкостном хроматографе Dionex UltiMate 3000 (Thermo Scientific, Германия), соединенном с масс-анализатором Maxis Impact qTOF с ЭРИ источником ионов (Bruker Daltonics, Германия). Разделение образцов осуществлялось методом обращенно-фазовой хроматографии на колонке Zorbax C18 (150×2,1 мм, 5 мкм, Agilent, США) с линейным градиентом от 30 до 90% элюента В (раствор ацетонитрил/изопропанол/вода, 90/8/2 об./об./об., с добавлением 0,1% муравьиной кислоты и 10 ммоль/л формиата аммония) за 20 минут. В качестве элюента А использовали раствор ацетонитрил/вода (60/40, об./об.) с добавлением 0,1% муравьиной кислоты и 10 ммоль/л формиата аммония. Скорость потока элюирования – 40 мкл/мин, объем инжектируемого образца – 3 мкл. Сбор масс-спектров осуществлялся в режиме положительных ионов в диапазоне m/z 100–1700 с нижеследующими параметрами: напряжение на капилляре 4,1 кВ, давление распыляющего газа 0,7 бар, скорость потока и температура осушающего газа 6 л/мин и 200°C. Для идентификации липидов выполняли тандемную масс-спектрометрию в режиме зависимого сканирования с шириной окна 5 Да. Уровень липидов был определен полуколичественным методом, представлен в условных единицах измерения.
Статистический анализ
Статистический анализ был проведен с использованием программного пакета Statistica 13.5.0. Для всех количественных показателей была проведена оценка соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро–Уилка. Числовые параметры, имеющие нормальное распределение, представлены в формате М (SD), где М – среднее значение, SD – стандартное отклонение среднего значения. Параметры, имеющие распределение, отличное от нормального, представлены в формате Ме (Q1;Q3), где Мe – медиана, Q1 и Q3 – нижний и верхний квартили. Для качественных и порядковых показателей были рассчитаны частоты (%). Для нахождения различий между двумя группами пациентов для нормально распределенных числовых показателей использовали t-критерий Стъюдента для двух независимых выборок, в случае распределения, отличного от нормального, применяли непараметрический метод U-критерия Манна–Уитни для несвязанных совокупностей. Для сравнения бинарных признаков между независимыми выборками и установления достоверных различий между ними использовался точный критерий Фишера для небольших выборок. Величину порогового уровня значимости p принимали равной 0,05. Корреляционный анализ проводили с использованием непараметрического корреляционного критерия Спирмена.
Результаты
Участники исследования были разделены на две группы в зависимости от стадии репродуктивного старения: 1-я состояла из 62 женщин в ранней фазе МП (-2 по STRAW +10), средний возраст 45,8 (2,36) года, 2-я – из 63 женщин в поздней фазе МП (-1 по STRAW +10), средний возраст 48,1 (2,58) года. При изучении клинико-анамнестических и гормональных характеристик сравниваемые группы различались по возрасту и уровню ФСГ, которые были выше в поздней фазе, а также по уровню эстрадиола, который был выше в ранней фазе, р<0,001 (табл. 1).
При оценке композиционного состава тела значимых различий между группами обнаружено не было (табл. 2). Биохимические показатели углеводного и липидного обмена, уровень мочевой кислоты, высокочувствительного СРБ, лептина, адипонектина, а также частота артериальной гипертензии и метаболических нарушений (дислипидемии, ИР, МС) в группах значимо не различались. У пациенток в поздней фазе МП уровень систолического АД был выше, чем в ранней фазе, р=0,029 (табл. 2).
Затем был исследован липидный профиль сыворотки крови пациенток методом ВЭЖХ-МС. У женщин в ранней и поздней фазе МП имелись статистически значимые различия в уровнях 14 липидов, р<0,05 (табл. 3).
У женщин в поздней фазе МП отмечались более высокие уровни церамида Cer(d18:1/22:0), окисленных фосфолипидов OxLPC(24:1(OOOO)), OxPC(18:0_18:4(Ke,OH)), OxPC(20:4_14:0(COOH)), фосфолипидов PC(18:1_18:1), PC(18:0_20:2), PEtOH(18:0_24:0), PI(18:1_18:2) и сфингомиелина SM(d26:0/16:1), которые по результатам корреляционного анализа имели положительную связь с уровнем ФСГ, ХС-ЛПНП, КА, глюкозы, инсулина, индекса HOMA, HbA1c, значениями систолического и диастолического АД (рисунок). Наиболее сильная связь определялась между Cer(d18:1/22:0) и инсулином (r=0,469; 95% ДИ 0,207–0,668; р=0,001), OxPC(18:0_18:4(Ke,OH)) и индексом НОМА (r=0,490; 95% ДИ 0,219–0,691; р=0,049), PC(18:0_20:2) и систолическим АД (r=0,434; 95% ДИ 0,158–0,648; р=0,003), SM(d26:0/16:1) и глюкозой (r=0,421; 95% ДИ 0,184–0,611; р=0,001).
У женщин в ранней фазе МП отмечались более высокие уровни окисленных фосфолипидов OxPC(16:0_20:5(OOO)), OxPE(22:6_16:1(COOH)) и фосфолипидов PC(16:0_18:1), PE(18:0_20:4), Plasmanyl-PC(O-18:1/20:4). По результатам корреляционного анализа Plasmanyl-PC(O-18:1/20:4) имел отрицательную связь с уровнем HbA1c (r=-0,337; 95% ДИ -0,574–-0,048; р=0,024) и систолического АД (r=-0,306; 95% ДИ -0,544–0,002; р=0,043). Результаты корреляционного анализа представлены на рисунке.
Обсуждение
У женщин в поздней фазе МП определялся более высокий уровень церамида Cer(d18:1/22:0), имеющего положительную связь с ХС-ЛПНП, КА, инсулином и индексом НОМА. Церамиды являются сфинголипидами, которые, наряду со своими структурными функциями в клеточных мембранах, играют роль вторичных мессенджеров во внутри- и межклеточных сигнальных путях. Выступая в роли вторичных мессенджеров, церамиды повышают экспрессию цитокинов (фактора некроза опухолей альфа (TNF-α), интерлейкина-6 (IL-6)), СРБ, продукцию активных форм кислорода, что приводит к развитию атеросклероза [11]. Кроме того, церамиды играют ключевую роль в индукции апоптоза β-клеток поджелудочной железы, ИР и снижении экспрессии гена инсулина [5]. По данным исследований, более высокий уровень Cer(d18:1/22:0) ассоциирован с большей выраженностью стеноза коронарных артерий и повышенным риском ишемического инсульта у пациентов с ИБС, а также повышенным риском СД 2 типа [6,12,13]. Было установлено, что уровень Cer(d18:1/22:0) повышается за 5 лет до постановки диагноза СД 2 типа, что позволяет его использовать в качестве раннего биомаркера этого заболевания [14].
В поздней фазе МП у женщин определялся более высокий уровень сфингомиелина SM(d26:0/16:1) – сфинголипида, имеющего положительную связь с уровнем глюкозы натощак. В литературе имеются сведения о роли сфингомиелинов в развитии ИР [15]. Было обнаружено, что избыточное накопление висцерального жира ассоциировано с увеличением концентрации сфингомиелинов. При блокировании сфингомиелинсинтазы-2, ответственной за синтез сфингомиелинов, у мышей отмечалось снижение уровня сфингомиелинов в крови и повышение чувствительности к инсулину [15]. Создание препаратов, регулирующих метаболизм сфинголипидов, является новым направлением в лечении ожирения и СД 2 типа [15]. В плазме крови 87% всех сфингомиелинов находятся в составе липопротеинов. Липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) содержат 63–75%, а ЛПВП – 25–35% сфингомиелинов плазмы крови [16]. К настоящему времени накоплены данные о гетерогенности ЛПВП по плотности и размеру, что обусловлено различным содержанием в их составе белков – аполипопротеинов и липидов (в том числе сфингомиелинов). Выделяют ЛПВП2, богатые липидами и характеризующиеся несколько большим размером и меньшей плотностью, а также ЛПВП3, богатые белком и имеющие меньший размер и большую плотность. В ЛПВП2 содержится больше сфингомиелина относительно других липидных соединений, чем в ЛПВП3, в результате чего изменяются структура частиц ЛПВП и способность осуществлять обратный транспорт ХС. Было показано, что ЛПВП3 обладают большей антиатерогенной активностью (способностью к обратному транспорту ХС), антиоксидантным эффектом в отношении окисления ЛПНП, а также антитромботической, противовоспалительной и антиапоптотической активностью по сравнению с ЛПВП2 [16]. ЛПНП, присутствующие в атеросклеротических бляшках, характеризуются высоким содержанием сфингомиелина. Таким образом, нарушение регуляции синтеза и транспорта сфингомиелинов является звеном патогенеза ССЗ [16].
Окисленные фосфолипиды, к которым относятся OxLPC(24:1(OOOO)), OxPC(18:0_18:4(Ke,OH)), OxPC(20:4_14:0(COOH)), определялись в более высокой концентрации в поздней фазе МП, а OxPC(16:0_20:5(OOO)), OxPE(22:6_16:1(COOH)) определялись в более высокой концентрации в ранней фазе. Окисление фосфолипидов происходит с участием активных форм кислорода и азота, которые могут быть эндогенного (митохондриальная дыхательная цепь, миелопероксидаза и др.) или экзогенного (загрязнение воздуха, курение и др.) происхождения. За последние годы окисленным фосфолипидам отводится все более важная роль как в нормальных, так и патологических процессах. Окисленные фосфолипиды участвуют в регуляции воспаления, тромбообразования, ангиогенеза, функции эндотелиального барьера, иммунной толерантности и других важных процессов. Множество исследований продемонстрировало, что окисленные фосфолипиды индуцируют провоспалительные и протромботические эффекты в эндотелиальных клетках, гладкомышечных клетках сосудов, лейкоцитах и тромбоцитах [17–19]. Кроме того, окисленные фосфолипиды индуцируют рост vasa vasorum и стимулируют фенотипическую модуляцию гладкомышечных клеток, являющихся важным этапом развития атеросклеротического поражения. Эти результаты свидетельствуют о роли окисленных фосфолипидов в патогенезе атеросклероза и его осложнений. Однако окисленные фосфолипиды способны индуцировать плейотропные эффекты: параллельно с индукцией медиаторов воспаления и молекул клеточной адгезии они активируют противовоспалительные пути и ингибируют острое воспаление в экспериментальных моделях у животных. На основании этих данных ученые полагают, что окисленные фосфолипиды играют роль в переходе от острого к хроническому воспалительному состоянию и могут являться биомаркерами атеросклероза, СД, рака и нейродегенеративных заболеваний [17–19].
Фосфолипиды, к которым относятся PC(18:1_18:1), PC(18:0_20:2), PEtOH(18:0_24:0), PI(18:1_18:2), определялись в более высокой концентрации в поздней фазе МП. PC(16:0_18:1), PE(18:0_20:4), Plasmanyl-PC(O-18:1/20:4) определялись в более высокой концентрации в ранней фазе. Фосфатидилхолины (PC) являются самыми распространенными компонентами клеточных мембран. Помимо структурной функции, фосфатидилхолины осуществляют взаимодействие с рецепторами, активируемыми пероксисомными пролифераторами (PPARs). PPARs – группа рецепторов клеточного ядра, функционирующих в качестве фактора транскрипции и регулирующих экспрессию генов [20]. PC(16:0_18:1), уровень которого выше у женщин в ранней фазе МП, является эндогенным лигандом ядерного рецептора PPARa в гепатоцитах – фактора транскрипции, регулирующего экспрессию многих генов, ответственных за метаболизм липидов. По данным исследования Chakravarthy M.V., введение PC(16:0_18:1) в воротную вену печени у мышей в течение нескольких дней способствовало снижению выраженности стеатоза печени [20]. На данный момент известно об еще одной важной функции фосфатидилхолинов, которые вместе с аполипопротеином В участвуют в секреции ЛПОНП. Дефицит фосфатидилхолинов, а также изменение их состава со снижением полиненасыщенных жирных кислот приводит к нарушению секреции ЛПОНП, результатом чего является избыточное накопление триацилглицеролов в печени с развитием стеатоза [7]. Можно предположить, что более низкие концентрации PC(16:0_18:1) у женщин в поздней фазе МП могут способствовать развитию стеатоза печени.
Фосфатидилхолины и фосфатидилэтаноламины (PE) являются наиболее распространенными фосфолипидами мембран митохондрий и играют важнейшую роль в их функционировании. Нарушение синтеза данных фосфолипидов может привести к митохондриальной дисфункции, которая ассоциирована с ССЗ, метаболическим синдромом, СД, нейродегенеративными заболеваниями и прогрессированием злокачественных новообразований [7]. В поздней фазе МП определялись более низкие концентрации фосфатидилэтаноламина PE(18:0_20:4). В исследованиях последних лет сообщается о роли фосфатидилэтаноламинов в развитии болезней Альцгеймера и Паркинсона [21]. У пациентов с болезнью Альцгеймера в сыворотке крови определяются более низкие концентрации фосфатидилэтаноламинов, в отличие от здоровых людей. Кроме того, у пациентов с легкими когнитивными нарушениями более низкая концентрация фосфатидилэтаноламинов является маркером ускоренного прогрессирования в болезнь Альцгеймера [22]. Существуют данные о том, что при низких уровнях фосфатидилэтаноламинов происходит повышенное накопление альфа-синуклеина, играющего важнейшую роль в патогенезе болезни Паркинсона [21].
Заключение
При отсутствии значимых различий в композиционном составе тела, метаболических параметрах использование омиксных технологий позволило выявить неоднородность липидного профиля по содержанию фосфо- и сфинголипидов у женщин в ранней и поздней фазе МП. Учитывая результаты корреляционного анализа липидов с метаболическими параметрами и сведения литературы об их роли в различных патофизиологических процессах, можно предположить, что изменение обмена фосфо- и сфинголипидов является патогенетическим аспектом развития кардиометаболических нарушений у женщин в период МП. Информация о сотнях видов липидов, получаемая с помощью масс-спектрометрии, расширяет возможности для детального изучения патогенеза различных заболеваний, ассоциированных с менопаузой, и определения терапевтических мишеней.
