Изучение аутоиммунных механизмов развития нарушений репродуктивной функции у женщин представляет большой научный и практический интерес для акушерства и гинекологии. В настоящее время создаются новые диагностические системы для выявления продукции аутоантител к мишеневым антигенам репродуктивной и эндокринной систем, среди которых гонадотропины и их рецепторы, стероидпродуцирующие клетки и стероидогенные ферменты [3, 7, 10, 11].
За последние 10 лет получены новые данные о важной физиологической функции хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) в репродуктивной системе [4, 8, 18]. Как известно, ХГЧ относится к семейству гликопротеиновых гормонов. Около 25–30% молекулярной массы ХГЧ составляют углеводы. На ранних сроках беременности инвазивными клетками цитотрофобласта продуцируется гипергликозилированный ХГЧ (гХГЧ), содействующий инвазии при имплантации эмбриона и становлении плацентации. Позже в синцитиотрофобласте образуется обычный ХГЧ, который способствует слиянию клеток цитотрофобласта в синцитиотрофобласт, поддерживает плацентацию и ангиогенез спиральных артерий миометрия [8, 18].
Имеются данные о возможности продукции высокоаффинных антител как к экзогенному, так и к эндогенному ХГЧ, способных нейтрализовать биологическую активность гормона in vitro и in vivo [6, 13, 17]. Установлено, что антитела, направленные к определенным антигенным эпитопам ХГЧ, способны узнавать рецептор и нейтрализовать его взаимодействие с гормоном [16].
Антитела к ХГЧ (анти-ХГЧ) рассматриваются как возможная причина невынашивания беременности и бесплодия [2, 6]. Течение беременности при наличии анти-ХГЧ характеризуется высокой частотой угрозы прерывания на ранних сроках гестации, развитием хронической формы синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания, плацентарной недостаточности [1, 2]. Спектр анти-ХГЧ представлен антителами, взаимодействующими как с цельной молекулой ХГЧ, так и с ее отдельными α- и β- субъединицами [3].
Кроме выявления антигенной направленности, важное клиническое значение имеет определение авидности и подклассов IgG, характеризующихся уникальными структурными и функциональными свойствами. Как известно, подклассы IgG имеют биологически важные функциональные различия по способности активировать систему комплемента, связыванию с поверхностными клеточными Fcγ-рецепторами, блокирующей активности, возможности проникновения через плацентарный барьер [12, 15]. Определение подкласса специфических антител дает возможность оценить их патогенетическую активность.
В связи с этим целью настоящего исследования было изучение распределения по подклассам и авидности IgG аутоантител к ХГЧ у женщин с нарушениями репродуктивной функции.
Материал и методы исследования
Женщины с нарушениями репродуктивной функции, обратившиеся в Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова, прошли клиническое и лабораторно-инструментальное обследование. Иммунологические исследования включали определение анти-ХГЧ и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) методом иммуноферментного анализа (ИФА).
Анти-ХГЧ определяли с использованием полистирольных микропланшетов (Nunc, Дания) с ХГЧ, иммобилизованным посредством мышиных моноклональных антител к α-субъединице ХГЧ [3].
Для определения подклассов IgG образцы сывороток крови исследовали в разведении 1:100 в дуб-лях. Конъюгаты мышиных моноклональных антител с биотином к IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека (Sigma-Aldrich Co., США) использовали в разведениях 1:4000, 1:15 000, 1:5000, 1:12 000; конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена (Sigma-Aldrich Co.) – в разведении 1:2000. Инкубацию проводили на встряхивателе при 20±2˚С в течение 1 ч, с конъюгатом стрептавидина — в течение 30 мин. Измерение оптической плотности (ОП) выполняли на фотометре MULTISKAN EX (Thermo Electron Co., Финляндия) при длине волны 450 нм. Результат считали положительным, если средняя ОП исследуемого образца сыворотки крови превышала более чем на три стандартных отклонения среднюю ОП, полученную в контрольной группе у здоровых фертильных женщин (n=30). Сыворотки крови исследовали однократно в дублях.
Для оценки авидности антител применяли методику, предложенную фирмой Вектор-Бест (Россия), с использованием диссоциирующего раствора, способствующего удалению с твердой фазы низкоавидных антител, с последующим рас-четом индекса авидности (ИА, в %) по формуле: ИА=ОП1×100/ОП ,где ОП — ОП в лунках с антителами после обработки диссоциирующим раствором (при 20±2˚С в течение 15 мин); ОП — ОП в лунках с антителами из того же образца сыворотки крови без обработки.
Для определения IgG-содержащих ЦИК, связанных с C1q (ЦИК-C1q) или с C3d (ЦИК-C3d), использовали иммуноферментные наборы IBL INTERNATIONAL (Германия) и BUHLMANN LABORATORIES AG (Швейцария).
Исследуемую группу составили 83 женщины с анти-ХГЧ IgG изотипа, 22 (26,5%) из них также с анти-ХГЧ IgM: Небеременных было 50 (60,2%) и беременных–33 (39,8%) женщины, у 16 (48,9%) из них наблюдалась угроза прерывания в I триместре. У 73 (87,9%) женщин имелись нарушения реп-родуктивной функции в анамнезе: у 46 (55,4%) — невынашивание беременности в I триместре, у 16 (34,8%) из них — 2 и более самопроизвольных потерь беременности, у 14 (16,9%) — первичное бесплодие, у 11 (13,3%) — вторичное бесплодие, у 2 (2,4%) — случаи преэклампсии и антенатальной гибели плода. У 16(19,3%) женщин с бесплодием ранее применялись вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ). Десять (12,1%) женщин не имели осложненного акушерского анамнеза.
Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel. Рассчитывались показатели подраздела «Описательная статистика» раздела «Анализ данных», для сравнения средних величин и оценки степени достоверности различий между выборками — критерий Стьюдента и χ2.
Результаты исследования и обсуждение
Распределение анти-ХГЧ по подклассам IgG и их уровень у женщин исследуемой группы представлены на рисунке. Частота выявления IgG1 (у 66, или 79,5%) была статистически значимо выше, чем IgG2 (у 44, или 53%) и IgG4 (у 39, или 47,0%) (p<0,01). IgG3 выявлялись статистически значимо реже других подклассов (у 8, или 9,6%); p<0,001). Уровни анти-ХГЧ подклассов IgG1 и IgG4 были статистически значимо выше, чем IgG2 и IgG3 (p<0,01).
У женщин исследуемой группы наблюдались разные спектры подклассов IgG. Наиболее часто выявлялись либо IgG1 при отсутствии других подклассов – у 19 (22,9%), либо сочетания двух или трех подклассов: IgG1 и IgG2 – у 12 (14,5%); IgG1 и IgG4 – у 13 (15,7%); IgG1, IgG2 и IgG4 – у 13(15,7%).
Анти-ХГЧ разных подклассов различались по авидности. Анти-ХГЧ с высокими значениями ИА (более 40%) встречались со следующей частотой: IgG1 — у 43 (51,8%) женщин, IgG2 – у 35 (42,2%), IgG4 — у 22 (26,5%). Средний показатель ИА IgG2 (67,8±17,5%) был статистически значимо выше, чем IgG1(46,8±15,9%) и IgG4 (43,7±15,1%) (p<0,05).
При невынашивании беременности анти-ХГЧ IgG1 подкласса выявлялись статистически значимо чаще – у 39 (84,8%), чем антитела других подклассов: IgG2 — у 22 (47,8%), IgG4 — у 19 (41,3%), IgG3 — у 5(10,9%) женщин (p<0,001). Наиболее часто выявлялись только IgG1 – у 11 (23,9%), или сочетания IgG1 и IgG4 – у 11 (23,9%), IgG1 и IgG2 – у 8 (17,4%). Средние ИА IgG1 (46,3±16,9%) и IgG2 (69,3±16,9%) были высокие, ИА IgG2 – статистически значимо выше, чем ИА IgG1 (p<0,05).
Беременные женщины с угрозой прерывания беременности в I триместре и без нее статистически значимо различались по частоте выявления анти-ХГЧ IgG2 – 11(68,8%) и 5 (29,4%) соответственно (p<0,05). У 3 беременных только с IgG4 беременность в I триместре протекала без осложнений.
У женщин с бесплодием с высокой частотой встречались анти-ХГЧ IgG1 – у18 (72%), IgG2 – у 16 (64%) и IgG4 – у 13 (52%). После применения ВРТ IgG1 выявлялись статистически значимо чаще (у 14, или 87,5%), чем IgG4 (у 8, или 50%) и IgG3 (у 2, или 12,5%) (p<0,05). IgG1 и IgG2 имели высокие средние ИА (45,6±13,3и 61,0±19,6%).
На наличие ЦИК-C1q и ЦИК-C3d обследовали 51 женщину. У 26 (50,9%) женщин наблюдалась положительная реакция на ЦИК: у 17 (33,3%) – на ЦИК-C1q, у 12 (23,5%) – на ЦИК-C3d. Средний уровень ЦИК-C1q составлял 12,4±6,9 мкг/мл, ЦИК-C3d — 30±4,7 мкг/мл.
У женщин с ЦИК с высокой частотой выявлялись анти-ХГЧ IgG1 и IgG2 – соответственно у 20 (76,9%) и у 18 (69,2%), статистически значимо чаще, чем IgG4, – у 11 (42,3%) и IgG3 – у 4(15,4%) (p<0,05). IgG1 и IgG2 имели высокие ИА (51,4±16,7 и 72,6±17,2%). Преобладали сочетания IgG1 и IgG2 или IgG1 и IgG4.
ЦИК были выявлены у 12 (48%) женщин с невынашиванием беременности, у 6 (54,5%) — с угрозой прерывания, у 9 (52,9%) — с бесплодием. При невынашивании беременности ЦИК-C1q выявлялись статистически значимо чаще (у 9 , или 36% женщин), чем ЦИК-C3d (у 3, или 12%) (p<0,05).
Таким образом, у женщин с анти-ХГЧ продуцировались IgG четырех подклассов. Учитывая высокую частоту встречаемости IgG1 и IgG2, можно предположить, что продукция анти-ХГЧ осуществлялась путем Т-зависимого и Т-независимого синтеза, запускалась как белковым, так и углеводным компонентами молекулы ХГЧ и, возможно, была направлена против гХГЧ. У женщин с анти-ХГЧ одного подкласса преобладали IgG1, которые, по-видимому, как антитела быстрого реагирования синтезировались первыми. С высокой частотой выявлялись IgG4, что могло быть связано с предрасполагающей к их продукции длительной антигенной стимуляцией самим ХГЧ во время беременности, а также близкими по антигенному строению гликопротеиновыми гормонами вне беременности.
Анти-ХГЧ IgG1 преобладали по частоте встречаемости при невынашивании беременности и после ВРТ, IgG1 и IgG2 — при угрозе прерывания беременности, при наличии ЦИК. IgG1 и IgG4 по сравнению с IgG2 имели более высокий уровень. IgG1 и IgG2 обладали более высокой авидностью, чем IgG4.
Наши результаты согласовались с данными U.S. Deshmukh и соавт., которые показали, что у женщин, иммунизированных контрацептивной вакциной, созданной на основе β-ХГЧ, продуцировались анти-ХГЧ всех 4 подклассов с преобладанием IgG1 [9]. При этом бионейтрализующая способность сывороток хорошо коррелировала с уровнем IgG1.
Как известно, антитела IgG1 подкласса наряду с IgG3 являются наиболее функционально активными и обладают высокой степенью связывания C1q-компонента комплемента и высокой эффективностью активации комплемента по классическому пути, а также способностью связываться с высокой аффинностью с поверхностными клеточными Fcγ-рецепторами, присутствующими на многих клетках человека (гемопоэтических клетках, клетках трофобласта и др.) [12, 14, 15].
IgG2 в меньшей степени активируют классический путь комплемента, но способны с высокой аффинностью связываться с Fcγ-рецепторами, которые экспрессируются на тромбоцитах, мононуклеарных фагоцитах и нейтрофилах, и активировать эти клетки, повышая риск развития тромботических и воспалительных осложнений [14].
Учитывая наличие у женщин анти-ХГЧ IgG1 и IgG2 подклассов, различающихся по их эффекторным функциям, можно предположить, что в патогенезе невынашивания беременности участвуют несколько разных механизмов. Высокая авидность анти-ХГЧ позволяет им реализовать свои эффекторные функции.
Как известно, в норме образовавшиеся иммунные комплексы фагоцитируются и разрушаются фагоцитами крови и печенью. Во время беременности избыток антигена, особенно выраженный в области трофобласта, и активный синтез анти-ХГЧ IgM могут приводить к увеличению размеров образующихся иммунных комплексов и отложению их в периваскулярном пространстве с последующей активацией комплемента и воспалительных процессов.
Наличие активации системы комплемента у женщин с анти-ХГЧ было подтверждено высокой частотой выявления ЦИК. У женщин с невынашиванием беременности достоверно чаще выявлялись ЦИК-C1q, чем ЦИК-C3d. Это позволяет предположить, что анти-ХГЧ могут вызывать осложнения течения беременности путем вовлечения классического, реже альтернативного, пути активации комплемента, с последующим повреждением плаценты продуктами распада, генерированными активацией комплемента. Кроме того, не исключается возможность прямого повреждающего воздействия анти-ХГЧ на клетки, продуцирующие ХГЧ и несущие специфические рецепторы. Последние широко распространены во всех тканях репродуктивных органов, включая эндотелий спиральных артерий миометрия [18].
В подтверждение наших предположений о возможных механизмах действия анти-ХГЧ при невынашивании беременности свидетельствуют данные патоморфологического исследования абортного материала, которые продемонстрировали у женщин с анти-ХГЧ высокую функциональную активность лимфоцитарных клеток на уровне d. basalis, активацию внутрисосудистого свертывания крови в спиральных артериях, атрофические изменения в синцитиотрофобласте ворсин и недостаточность инвазии трофобласта [1].
Обращает на себя внимание высокая частота встречаемости анти-ХГЧ IgG4. Патогенетическое значение IgG4 в настоящее время активно обсуждается. Известно, что IgG4 практически не активируют комплемент и не связываются с Fcγ-рецепторами клеток. Однако IgG4 обладают блокирующей активностью, конкурируют за связывание антигена с образованием мелких непреципитирующих ЦИК, тем самым способствуют ингибированию активации комплемента и уменьшению проявлений комплементопосредованной патологии [5, 12, 15].
Учитывая высокую частоту встречаемости IgG4 в сочетании с IgG1, можно предположить их возможное влияние в сторону уменьшения проявлений клинических нарушений, вызываемых IgG1. Однако, по данным U. S. Deshmukh и соавт., присутствие анти-ХГЧ IgG4 не оказывало существенного влияния на нейтрализацию биологической активности гормона IgG1 [9].
Продукция IgG4 зависит от T-хелперов 2-го типа и сопровождается повышенным синтезом IL-10 и других противовоспалительных цитокинов. Считается, что наличие специфических IgG4 указывает на активацию противовоспалительных, индуцирующих толерантность механизмов. IgG4 ассоциируются с патологией лишь в случае выраженных склеротических изменений, например при аутоиммунном панкреатите, отражая избыточную продукцию противовоспалительных цитокинов и экспансию плазматических клеток, продуцирующих IgG4 [5].
У нескольких женщин с продукцией анти-ХГЧ только IgG4 наблюдалось физиологическое течение настоящей беременности на ранних сроках. Однако, по данным П. А. Кирющенкова [1], при макро- и микроскопическом исследовании плацент женщин с анти-ХГЧ после своевременных родов имелись признаки нарушения процессов имплантации, в 80% случаев наряду с патологической незрелостью и отсутствием дифференцировки ворсин наблюдались выраженные склеротические изменения в их строме, одной из возможных причин которых могла быть продукция IgG4.
Учитывая ранние сроки потерь беременности, когда преобладает влияние гХГЧ, наличие про-дукции IgG2, индуцированной углеводным компонентом молекулы, и наблюдаемые нарушения процессов инвазии при имплантации и плацентации, можно предположить, что анти-ХГЧ способны нейтрализовать биологическую активность раннего гХГЧ. По-видимому, анти-ХГЧ, вызывая нарушения гемохориальной плацентации, могут служить возможной причиной развития гипертензивных нарушений и преэклампсии во II и III триместрах беременности.
Таким образом, у женщин с нарушениями репродуктивной функции наиболее часто выявлялись анти-ХГЧ IgG1, IgG2 и IgG4 подклассов с высоким индексом авидности, наблюдались разные спектры подклассов IgG. IgG1 превосходили другие подклассы по частоте выявления, IgG1 и IgG4 – по уровню антител. При невынашивании и угрозе прерывания беременности в I триместре, после применения ВРТ при бесплодии статистически значимо чаще выявлялись высокоавидные IgG1 и/или IgG2. В связи с этим мы предполагаем, что механизмы иммунопатогенеза невынашивания беременности при продукции анти-ХГЧ включают в себя активацию системы комплемента и эффекторных клеток. Оценка патогенетической активности анти-ХГЧ на основе определения их авидности и подклассов IgG может иметь практическое значение для прогнозирования течения беременности и развития нарушений репродуктивной функции.
