Работа выполнена при поддержке программы «Гранты Президента РФ для государственной поддержки ведущих научных школ Российской федерации» НШ-366.2012.7.
Важнейшим этапом физиологического течения беременности и развития плода является морфогенез сосудов плацентарной области матки и эмбриональный морфогенез кровеносной системы плода. Установлены два этапа морфогенеза сосудов: васкулогенез – первичное образование и развитие сосудов de novo из коммитированных мезодермальных клеток и ангиогенез – формирование новых сосудов из уже существующих сосудистых структур, которые в период беременности последовательно отражают формирование сосудистой системы зародыша и плаценты [1, 4, 8].
Наиболее значимые для ангиогенеза события происходят в ранние сроки беременности. Прежде всего,
это период до 6 нед беременности, когда формируется первичная эмбриональная кровеносная система и плацентарное ложе, развиваются ворсины, а также происходит интенсивная васкуляризация ворсинчатого дерева формирующейся плаценты. Период 6—8 нед беременности отмечен началом перехода к плацентарному кровообращению, а также наиболее выраженными процессами инвазии вневорсинчатого трофобласта в стенки спиральных артерий матери (так называемая первая волна инвазии трофобласта). Пограничный период 11—13 нед беременности характеризуется завершением эмбриогенеза и началом плодного периода развития, процессами «затухания» первой волны инвазии трофобласта и дальнейшим приростом объема маточно-плацентарного кровотока [3, 13, 14].
Ключевыми факторами, регулирующими ангиогенез гестационного периода, являются сосудисто-эндотелиальный фактор роста (VEGF) и фактор роста плаценты (PLGF) [7, 15, 17]. Специфическое влияние на эндотелий осуществляется посредством взаимодействия с рецепторами VEGF-R1, VEGF-R2, VEGF-R3, экспрессированными на эндотелиоцитах [20, 23]. Также существует большая группа факторов, влияние которых на ангиогенез носит неспецифический характер. К ней относят матриксные металлопротеиназы (MMP) и их тканевые ингибиторы (TIMP). Специфически гидролизуя компоненты внеклеточного матрикса и коллаген базальных мембран, MMP способствуют инвазии и миграции клеток, тем самым облегчая формирование и развитие сосудистой сети [5, 6, 10, 21].
Динамический баланс в системе лиганд/рецептор обеспечивает такое состояние системы, которое дает возможность осуществления ее функций, при условии стремления данной системы к гармоническому равновесию. Точка равновесия в таких системах непрерывно перемещается, поскольку лиганд/рецепторные пары, являясь сложными системами, испытывают влияние разнообразных факторов. С точки зрения теории динамического баланса позиции лиганда в данном исследовании занимают проангиогенные факторы, тогда как позиции рецептора — антиангиогенные факторы. Существующие модели, которые описывают взаимодействие членов семейст ва VEGF с рецепторами [16], а также членов семей ства ММР с ингибиторами [19], не дают количественных характеристик связывания в системе рецептор/лиганд для этих молекул.
Поэтому употребление каких-либо индексов или соотношений, характеризующих динамическую ситуацию, описанную в выбранный интервал времени как проангиогенное состояние или, наоборот, не представляется возможным. Для описания таких ситуаций возможно введение «суррогатных» индексов, характеризующих величину отношения лиганд/рецептор как наиболее адекватных для характеристики какого-либо процесса, в частности ангиогенеза. Использование таких соотношений может применяться для расчета риска развития осложнений беременности, например преэклампсии
[12, 22].
Целью настоящего исследования явился анализ изменений в ранние сроки беременности соотношения проангиогенных и антиангиогенных факторов в сыворотке крови женщин с невынашиванием беременности в анамнезе.
Материал и методы исследования
В проспективное исследование были включены 66 пациенток с беременностью ранних сроков.
Контрольную группу составили 20 пациенток с физиологическим течением беременности. Все женщины этой группы имели одну или две беременности в анамнезе, завершившихся родами в срок, без особенностей течения гестационного периода.
В основную группу включили 46 беременных женщин с невынашиванием в анамнезе и угрозой прерывания текущей беременности. Из них у 16 пациенток данная беременность завершилась рождением живого ребенка (основная подгруппа А) и у 30 пациенток была прервана по типу «замершая беременность» (основная подгруппа Б).
У пациенток основной подгруппы А и контрольной группы исследование ангиогенных факторов в образцах периферической крови осуществляли в сроки до 6 нед, 7–8 и 11–14 нед беременности. У пациенток основной подгруппы Б исследование проводили на момент постановки диагноза «замершая беременность» (на сроке до 6 нед были обследованы 8 пациенток, на сроке 7—8 нед – 14, на сроке 11—14 недель – 8 пациенток).
Критериями включения явились две и более ранние потери беременности в анамнезе, отсутствие родов в данном браке, одноплодная беременность, наступившая в естественном цикле.
Критериями исключения явились эндометриоз, синдром поликистозных яичников, миома матки, индуцированная беременность и/или экстрагенитальная патология (сахарный диабет, псориаз, системные и аутоиммунные заболевания, онкологические процессы), мутации генов фактора V и II свертывания крови, а также случаи активации бактериально-вирусной инфекции.
Диагноз привычного невынашивания беременности ставился по Международной классификации болезней 10-го пересмотра.
Забор периферической крови для исследования ангиогенных факторов осуществляли не позднее 5 дней после ультразвуковой (УЗ) констатации остановки развития беременности и при условии интактного хориона (отсутствие ретроплацентарных и/или ретроамниотических гематом, кровянистых выделений из половых путей).
Диагностика срока беременности осуществлялась на основании УЗ-исследования и уровня β-субъединицы хорионического гонадотропина.
По возрасту пациентки всех групп, включенные в исследование, были сопоставимы.
Образцы крови у пациенток забирали из локтевой вены. Сыворотку получали стандартным способом:
образцы отстаивали при комнатной температуре до образования сгустка, центрифугировали при 3000 об/мин, надосадок помещали в пробирку типа Эппендорф и хранили при температуре -80 °С.
Определение растворимых форм VEGF, sVEGF-R1, sVEGF-R2, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2
и PLGF в сыворотке крови осуществляли путем иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием стандартных тест-систем фирмы Bender MedSystems GmbH (Австрия) и R&D Systems (США). Измерение оптической плотности производили с помощью планшетного ридера BioTek (США) при длине волны 450 нм. Построение калибровочного графика и расчет концентраций VEGF, sVEGF-R1, sVEGF-R2, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 и PLGF производили по уравнениям линейной регрессии в логарифмических координатах.
Анализ содержания измеренных растворимых про- и антиангиогенных факторов представлен в предыдущей работе тех же авторов [2]. По полученным результатам в настоящей работе рассчитывали соотношения про-и антиангиогенных факторов.
Статистическую обработку данных производили с использованием пакета статистического анализа для Microsoft Office Exсel 2007. Достоверность различий средних значений расчетных показателей оценивали с помощью двухвыборочного t-теста с различными дисперсиями. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.
Результаты исследования и обсуждение
Рассчитанные соотношения содержания лигандрецепторных пар (VEGF/VEGF-R1, VEGF/VEGF-R2,
PLGF/VEGF-R1, MMP-9/TIMP-1, MMP-2/TIMP-2) представлены на рисунке.
Отношение VEGF к рецептору sVEGF-R1 (VEGF/VEGF-R1) у пациенток контрольной группы
характеризуется на сроке беременности до 6 нед значением, равным 0,562, что достоверно выше значения данного соотношения в А и Б подгруппах основной группы, которое составляет 0,178 и 0,0312 соответственно. Внутри контрольной группы отмечаются достоверно значимые отличия по сравнению со сроком до 6 нед беременности. Интересно отметить, что динамика изменения соотношения VEGF/VEGF-R1 в основной подгруппе А имеет похожие тенденции с контрольной группой. В основной подгруппе Б значения лиганд/рецепторных пар значительно снижены, за
исключением последнего срока обследования (0,0086), по сравнению с контрольной (0,006) и подгруппой А (0,0024).
Отношение VEGF к рецептору sVEGF-R2 (VEGF/VEGF-R2) имеет аналогичную динамику.
Так, на сроке до 6 нед беременности достоверные отличия имеются только в подгруппе Б (0,0023) по сравнению с контрольной группой (0,020) и подгруппой А (0,011). Причем по динамике изменения соотношения контрольная и основная А группы совпадают, обнаруживая при этом достоверные различия на интервале 7—8 нед. Подгруппа Б характеризуется минимальными значениями соотношения, которое достоверно значимо отличается в сроках до 6 и в
7—8 нед беременности по сравнению с другими группами, не имея при этом достоверных различий внутри группы на всех исследованных сроках беременности.
Известно, что действие VEGF на эндотелиальные клетки осуществляется посредством связывания с рецепторами VEGF-R1и VEGF-R2, причем в ранние сроки беременности аффинность связывания с VEGF-R1 в 10 раз превышает связывание с VEGF-R2 [18]. Активация VEGF-R2 приводит к
стимуляции ангиогенеза путем запуска пролиферации, миграции и дифференцировки, а также торможения апоптоза эндотелиальных клеток. Действие активированного VEGF-R1 рецептора реализуется в активации межклеточных взаимодействий, разветвлении сосудистой сети и процессах инвазии трофобласта в спиральные артерии [24]. Применение блокирующих антител к VEGF-R2 вызывает редукцию децидуального ангиогенеза и потерю беременности у мышей, использование антител аналогичного действия к VEGF-R1 не вызывает таких эффектов [11]. В других исследованиях, отсутствие у экспериментальных животных VEGF-R1 приводило к гиперпродукции дезорганизованных сосудов и скоплений эндотелиальных клеток, а отсутствие VEGF-R2 – к снижению развития сосудистой сети [8]. По данным литературы, ключевым рецептором для VEGF на ранних сроках беременности является VEGF-R2 [11, 20].
Рисунок. Соотношение ангиогенных факторов и их рецепторов в сыворотке крови женщины в первом триместре беременности.
В нашем исследовании полученные значения лиганд/рецепторных пар для VEGF и рецепторов
sVEGF-R1и sVEGF-R2 позволяют предположить, что характер изменения соотношения VEGF/VEGF-R1 и VEGF/VEGF-R2 во всех точках наблюдения отражает реализацию процессов, осуществляемых этими факторами, и являющихся значимыми для нормального течения и исхода беременности. Поскольку образование активного комплекса VEGF/VEGF-R1 влияет, главным образом, на процессы дифференцировки и миграции клеток трофобласта, а также регулирует инвазию трофобласта [24], то максимальные значения, наблюдаемые в контрольной группе во всех точках наблюдения, отражают оптимальный баланс факторов, устанавливающийся в динамической системе в
исследованные сроки.
Обнаружено, что на сроке до 6 нед беременности значение соотношения VEGF/VEGF-R1 в контрольной группе имеет максимальное значение и, вероятно, отражает максимальные потенции в дифференцировке и миграции клеток трофобласта и эндотелия, что является наиболее значимым для развития беременности на этом сроке. Сниженные значения соотношения в основной подгруппе А (в 3 раза) и особенно в подгруппе Б (более чем в 18 раз), статистически значимо отражают недостаточный активационный ответ и сниженную функциональную активность клеток, что является критическим для беременности. Аналогичная тенденция для данного соотношения наблюдается и на других сроках, однако отсутствие достоверных различий с контрольной группой позволяет предполагать, что отношение VEGF/VEGF-R1 имеет критическое значение до 6 нед гестации. Характер изменения соотношения в системе VEGF/VEGF-R2 позволяет предположить существование аналогичной
VEGF/VEGF-R1 закономерности функционирования данной лиганд/рецепторной пары в циркуляции. По данным литературы известно, что VEGF/VEGF-R2 регулирует развитие фетоплацентарного комплекса [24], а также выполняет функции паракринной системы в процессах формирования примитивной сосудистой сети эмбриона [20]. Недавно также появились данные, что при развитии преэклампсии происходит снижение содержания sVEGF-R2 в периферической крови уже на ранних сроках беременности до проявления клинических симптомов заболевания, в то время как содержание sVEGF-R1, наоборот, повышается [9]. Таким образом, несмотря на бóльшую аффинность связывания VEGF с VEGF-R1, чем с VEGF-R2, наблюдаемые уровни содержания рецепторов в крови при преэклампсии связаны скорее с изменением активации экспрессии генов, а не с изменением биодоступности рецептора [9].
По-видимому, максимальное значение соотношения VEGF/VEGF-R2 в контрольной и основной А
группах на сроке до 6 нед беременности свидетельствует о высокой активности факторов в процессах васкуляризации ворсин формирующейся плаценты и эмбрионального ангиогенеза. Достоверно сниженное значение соотношения в основной подгруппе Б, вероятно, свидетельствует о нарушениях в формировании ранней плаценты и неадекватном ангиогенезе в эти сроки гестации. Характер изменения соотношения факторов VEGF/VEGF-R2 в исследованные сроки
во всех группах свидетельствует об исключительной важности данной лиганд/рецепторной пары на первых неделях гестации. Наиболее значимым представляется снижение соотношений VEGF/VEGF-R1 и VEGF/VEGF-R2 при проявлениях патологии.
Фактор PLGF осуществляет свое воздействие на эндотелий через специфическое связывание с рецептором VEGF-R1. По данным литературы, PLGF воздействует больше на процессы ангиогенеза, чем васкулогенеза, однако также отмечается, что PLGF и VEGF-R1 влияют на мобилизацию мезенхимальных предшественников эндотелиальных клеток, которые участвуют в васкулогенезе [8]. PLGF усиливает ангиогенез, действуя синергично с VEGF, а также способен замещать VEGF в комплексе VEGF/VEGF-R1, высвобождая его для активации VEGF-R2. Известно также, что PLGF является паракринным регулятором децидуального ангиогенеза и аутокринным регулятором функций клеток трофобласта в процессах дифференцировки и инвазии [20], а также основным регуляторным фактором при неосложненной беременности в I триместре [8, 20].
Соотношение PLGF и sVEGF-R1 (PLGF/VEGF-R1) для каждой группы беременных имеет свои тенденции. Достоверно значимые отличия наблюдались на сроках до 6 нед и 7—8 нед беременности в основной подгруппе А по отношению к контрольной. Однако имелся значительный дисбаланс содержания факторов в лиганд/рецепторной паре PLGF/VEGF-R1, проявляющийся в значительных отклонениях от среднего значения соотношения факторов на сроке 7—8 нед беременности в подгруппе Б. Кроме того, отмечались низкие значения соотношения лиганд/рецепторной пары в основной подгруппе А во всех исследованных точках наблюдения. Однако низкие значения данного соотношения в основной подгруппе А не являются драматическими для развития беременности. Они могут быть обусловлены изменениями в динамической системе PLGF/VEGF-R1 как в сторону увеличения содержания sVEGF-R1, так и уменьшения PLGF. Полученные значения соотношения для данной лиганд/рецепторной пары для всех групп на ранних сроках беременности, по-видимому, свидетельствуют о существовании допустимых колебаний значений факторов, составляющих эту пару, не являющихся значимыми для продолжения беременности.
Анализ полученных результатов показал отсутствие достоверно значимых различий по отношению свободной формы MMP к тканевым ингибиторам TIMP (MMP/TIMP) между группами на
большинстве исследованных сроков беременности. Значимые различия установлены для соотношения MMP-9/TIMP-1 на сроке 11—14 нед для основной подгруппы Б (0,91) по сравнению с контрольной группой (1,48). Достоверно сниженное значение данного соотношения в этой группе может свидетельствовать об особенностях процессов деградации и аутолиза при замершей беременности. Характер изменения соотношений данных лиганд/рецепторных пар внутри исследованных групп свидетельствует о некотором стабильно существующем динамическом равновесии в значениях содержания факторов. Вероятно, неспецифические воздействия на процессы ангиогенеза, осуществляемые этими факторами в рассматриваемых лиганд/рецепторных парах, имеют некоторый консервативный характер, заключающийся в предотвращении избыточной протеазной активности и являющийся достаточным для протекания адекватного ангиогенеза в анализируемые временные интервалы беременности. Однако использование данных соотношений не является информативным для характеристики патологических процессов на данных сроках у этих групп пациенток за исключением соотношения MMP-9/TIMP-1 на сроке 11—14 нед беременности.
Анализ соотношений про- и антиангиогенных факторов дополняет результаты, описанные в предыдущем исследовании [2]. Наиболее информативными являются соотношения VEGF/VEGF-R1 и VEGF/VEGF-R2 и MMP-9/TIMP-1. Критическое снижение соотношения VEGF/VEGF-R1 и VEGF/VEGF-R2 является значимым на сроке до 6-нед беременности. Напротив, значимые отличия в содержании ММР и их ингибиторов, выявленные на сроках до 6 нед и 7–8 нед беременности, в соотношениях не информативны. В то же время снижение соотношения MMP-9/TIMP-1 на сроке 11—14 нед может служить одним из факторов, сигнализирующих о развитии критических последствий.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности использования анализа лиганд/рецепторных пар в характеристике патологических процессов на ранних сроках беременности. В настоящем исследовании выявлены различия в соотношении факторов, регулирующих ангиогенез гестационного периода между группами с удачными и неудачными перинатальными исходами, особенно выраженные у пациенток с замершей беременностью на ранних сроках, что может иметь прогностическое значение.
