Использование проточной цитофлюорометрии при обследовании супружеских пар с бесплодием

М.А. Николаева, А.С. Арефьева, Е.О. Степанова, Е.Л. Голубева, И.В. Ушакова, Л.В. Кречетова

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения РФ, Москва, ул. Академика Опарина, 4

Проточная цитофлюориметрия (ПЦМ) является высокотехнологичным методом быстрого анализа клеток или микрочастиц, находящихся в суспензии. Этим методом на выборках от нескольких тысяч до нескольких миллионов клеток могут исследоваться множество клеточных характеристик – поверхностные и внутриклеточные молекулы и структуры, функциональная и ферментативная активность, стадии пролиферативного цикла. Проточная цитометрия широко используется при изучении молекулярных и клеточных механизмов функционирования мужской репродуктивной системы. В настоящее время большое внимание уделяется выявлению нарушений функций сперматозоидов, определяющих их сниженную оплодотворяющую способность, у пациентов с нормальными показателями спермограммы.

Маркером нарушения репродуктивной функции является присутствие антиспермальных антител (АСАТ), взаимодействующих с антигенами живых сперматозоидов, в сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта у мужчин и у женщин. Поэтому первой попыткой использования ПЦМ для диагностики нарушений репродуктивной функции у мужчин явилась разработка метода выявления АСАТ на поверхности живых сперматозоидов [1]. Однако было установлено, что клеточная реакция сперматозоидов, индуцируемая образованием поверхностных комплексов антиген-антитело, может приводить к активации метаболизма сперматозоидов, акросомной реакции, разрушению мембран клеток и получению ложнонегативных результатов при выявлении АСАТ [2,3]. Поэтому мы отказались от применения ПЦМ для диагностики мужского аутоиммунного бесплодия, однако предложенный нами метод используется для диагностики иммунного фактора бесплодия у женщин. Наличие АСАТ IgG, IgA и IgM классов в цервикальной слизи выявляется у 22% пациенток с бесплодием неясного генеза.

Одной из возможных причин бесплодия может быть сниженная оплодотворяющая способность сперматозоидов, обусловленная нарушениями акросомной реакции (АР) – рецептор-опосредованного экзоцитоза акросомного содержимого, обеспечивающего проникновение сперматозоида через оболочки яйцеклетки. Нами разработан объективный способ оценки АР с помощью окрашивания сперматозоидов двумя флуоресцентно меченyыми лектинами – ТРИТЦ-A.hypogaea, связывающимся с b-D-галактозильными остатками, локализованными на наружной акросомной мембране, и ФИТЦ-P.sativum, который взаимодействует с основным компонентом акросомного матрикса – акрозином [4]. Предложенный метод позволяет эффективно диагностировать бесплодие, обусловленное дисфункцией сперматозоидов, у 32% бесплодных пациентов с нормальными показателями спермограммы.

Молекулярные аспекты АР в настоящее время активно исследуются, однако до сих пор не идентифицированы поверхностные рецепторы сперматозоидов, обеспечивающие связывание гамет с физиологическими лигандами. Поэтому большой интерес представляет недавно выявленная активность ангиотензинпревращающего фермента, локализованного на поверхности сперматозоидов (5) и, по-видимому, непосредственно влияющего на процесс оплодотворения [6].

Современным подходом к выявлению дисфункций сперматозоидов является оценка качества ДНК и хроматина с помощью методов TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferases dUTP Nick End-Labeling). Метод TUNEL включает в себя прямое мечение одно- и двухцепочечных разрывов («ников») в ДНК. В качестве флуорохрома обычно используется флюоресцеин. Интенсивность флюоресценции пропорциональна числу встроенных dUTP и, соответственно, числу разрывов в ДНК. Однако данные об эффективности использования предлагаемого метода в клинической практике остаются спорными [7].

Внедрен в практику лаборатории новый метод анализа клеточного состава эякулята. Оценивается степень связывания флуоресцентного зонда пропидия иодида с ДНК сперматозоидов, лейкоцитов и клеток сперматогенеза. Тест предназначен для выявления факторов мужского бесплодия - лейкоцитоспермии и нарушений сперматогенеза.

Исследования, проведенные на экспериментальных животных, с очевидностью доказали ключевую роль семенной плазмы (СП) в иммунорегуляции имплантации. С помощью мультиплексного анализа цитокинового состава семенной плазмы нами было впервые установлено, что контакт с СП полового партнера в цикле ЭКО/ИКСИ может оказывать как благоприятное, так и негативное влияние на частоту наступления беременности, что определяется цитокиновым статусом семенной плазмы полового партнера [8, 9]. Очевидно, что при избытке содержания компонентов СП, оказывающих неблагоприятное влияние на имплантацию, решающее значение для повышения эффективности ЭКО может иметь ограничение поступления СП в репродуктивный тракт женщины.

Использование проточной цитофлуориметрии может внести существенный вклад в развитие представлений о молекулярных основах репродукции человека, а также иметь большое практическое значение для диагностики бесплодия у мужчин и выбора оптимальных способов коррекции репродуктивной функции.

Список литературы

  1. Nikolaeva MA, Kulakov VI, Ter-Avanesov GV, Terekhina L.N., Pshenichnikova T.Ja., Sukhikh G.T. Detection of antisperm antibodies on the surface of living spermatozoa using flow cytometry: preliminary study. Fertility and Sterility; 1993; 59 (3): 639–644.
  2. Nikolaeva MA, Kulakov VI, Korotkova IV, Golubeva EL, Koujavskaja DV, Sukhikh GT. Antisperm antibodies detection by flow cytometry is affected by aggregation of antigen-antibody complexes on the surface of spermatozoa. Human Reproduction. 2000; 15 (12): 2545–2553.
  3. Nikolaeva MA, Goukasian IA, Filippova RD, Korotkova IV, Sukhikh GT. Flow Cytometry study on the effect of serum and peritoneal fluid of women on the sperm-binding activity of IgG antisperm antibodies. Fertility and Sterility. 1997; 67 (4): 680–686.
  4. Nikolaeva MA, Golubeva EL, Kulakov VI, Sukhikh GT. Evaluation of stimulus-induced acrosome reaction by two-colour flow cytometric analysis. Molecular Human Reproduction. 1998; 4 (3): 243–250.
  5. Nikolaeva MA, Balyasnikova IV, Alexinskaya MA, Metzger R, Franke FE, Albrecht RF.II, Kulakov V, Sukhikh GT, Danilov SM. Testicular isoform of angiotensin I-converting enzyme (ACE, CD143) on the surface of human spermatozoa: revelation and quantification using monoclonal antibodies. Am.J.Reprod.Immunol. 2006; 55 (1): 54–68.
  6. Kondoh G, Tojo H, Nakatani Y, Komazawa N, Murata C, Yamagata K, Maeda Y, Kinoshita T, Okabe M, Taguchi R, Takeda J. Angiotensin-converting enzyme is a GPI-anchored protein releasing factor crucial for fertilization. Nat Med. 2005.Feb; 11(2): 160–6.
  7. Cissen M, Wely MV, Scholten I, Mansell S, Bruin JP, Mol BW, Braat D, ReppingS, Hamer G. Measuring Sperm DNA Fragmentation and Clinical Outcomes of Medically Assisted Reproduction: A Systematic Review and Meta-Analysis. PLoS One. 2016 Nov 10; 11(11):e0165125. doi: 10.1371
  8. Nikolaeva MA, Babayan AA, Stepanova EO, Smolnikova VY, Kalinina EA, Fernández N, Krechetova LV, Vanko LV, Sukhikh GT. The relationship of seminal transforming growth factor-β1 and interleukin-18 with reproductive success in women exposed toseminal plasma during IVF/ICSI treatment. J Reprod Immunol. 2016 Sep; 117: 45–51.
  9. Nikolaeva M, Babayan A, Stepanova E, Arefieva A, Dontsova T, Smolnikova V, Kalinina E, Krechetova L, Pavlovich S, Sukhikh G. The Link Between Seminal Cytokine Interleukin 18, Female Circulating Regulatory T Cells, and IVF/ICSI Success. Reprod Sci. 2018 Oct 16: 1933719118804404.doi: 10.1177/1933719118804404.
Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.