Высокая распространенность бесплодного брака в Российской Федерации объясняет всеобщее внимание к этой проблеме. По статистике Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) с данной проблемой сталкиваются не менее 15% супружеских пар репродуктивного возраста [1].
По данным Gunbi J. et al. [2] только треть циклов ВРТ приводит к развитию беременности и около четверти из них – к рождению ребенка. Самым простым подходом к повышению этих показателей является перенос одновременно нескольких эмбрионов, однако это сопряжено с высокой вероятностью развития многоплодной беременности [3]. По данным литературы, для снижения риска наступления многоплодной беременности целесообразно проведение селективного переноса эмбриона [4–7]. Стимуляция суперовуляции в программе ВРТ проводится с целью получения достаточно большого количества ооцитов для того, чтобы снизить риск неудачи ЭКО путем выбора наиболее «качественного» эмбриона для переноса [8].
Имплантация эмбриона – сложный многоступенчатый процесс с вовлечением большого числа гуморальных факторов и каскада разнообразных межмолекулярных и межклеточных взаимодействий. Продолжает оставаться актуальной проблема повторных неудач имплантации в программах ВРТ. Основными причинами этого могут быть: сниженная рецептивность эндометрия, несостоятельность диалога между эндометрием и эмбрионом, неудовлетворительное качество эмбриона [9–15].
Последовательный сложный процесс имплантации контролируется различными молекулярными факторами [16–18]:
- сигнальными цитокинами;
- факторами роста;
- молекулами адгезии.
Клетки кумулюса – это клетки, формирующие непосредственное окружение ооцита при созревании фолликула и происходящие из низкодифференцированных предшественников – клеток гранулезы [19]. Многочисленные исследования указывают на то, что клетки кумулюса координируют созревание ооцитов с развитием фолликулов, продвигают ядерное и цитоплазматическое ооцитарное созревание, обеспечивают энергией субстраты для возобновления мейотического созревания ооцитов, которое необходимо для формирования пронуклеусов после оплодотворения и дальнейшей способности к развитию [20]. Главная функция кумулюса состоит в обеспечении транспорта сигнальных молекул и метаболитов между ооцитом и тканью яичника. С другой стороны, ооцит в созревающем фолликуле секретирует факторы роста, действующие локально, управляя функцией и дифференцировкой кумулюсных клеток [21].
Кумулюсные клетки играют основную роль в двусторонней передаче сигналов к ооциту. Важность данных сигнальных путей не может быть переоценена и является жизненно важной для производства жизнеспособных гамет [21]. Принимая во внимание двунаправленную передачу сигналов между ооцитом и кумулюсными клетками, предполагается, что состояние метаболических процессов и энергопреобразующих систем в кумулюсных клетках могут отражать уровень метаболизма ооцита, определяющий его способность к дальнейшему созреванию, последующему успешному оплодотворению и дальнейшему развитию. Среди генов, дифференциально экспрессирующихся в кумулюсных клетках при разных условиях, внимание ученых в настоящее время наиболее привлекают гены митохондриального биогенеза в связи с тем, что они являются контролерами точек сопряжения путей дифференцировки и метаболических процессов [22].
Считается, что аутологичное сокультивирование эмбрионов с клетками кумулюса повышает эффективность программ ВРТ у пациенток с множественными неудачными попытками ЭКО в анамнезе, т.к. улучшаются качественные характеристики эмбрионов и повышается частота имплантации [23, 24] за счет детоксикации среды культивирования и секреции эмбриотропных веществ, таких как цитокины, факторы роста, стероидные гормоны и интерлейкины [24, 25]. Фидерные клетки метаболизируют глюкозу, находящуюся в культуральной среде, тем самым давая возможность эмбрионам находиться в среде с адекватным для них содержанием сахара [26]. В литературе получены данные об осуществлении процесса сокультивирования на поверхности монослоя пролиферирующих клеток фаллопиевых труб, эндометрия, маточных фибробластов и кумулюсных клеток [27‒30].
Аутологичное сокультивирование клеток кумулюса проводится одновременно с культивированием эмбрионов текущей программы ЭКО [31].
Quinn P., et al. одни из первых провели проспективное исследование, в котором была отмечена разница скорости развития эмбрионов между классическим методом культивирования и сокультивированием с клетками кумулюса. В группе с использованием сокультивирования с клетками кумулюса на 6-е сутки культивирования 98 эмбрионов (45%) из 216 достигли стадии бластоцисты, а в группе с классическим методом культивирования 48 эмбрионов (31%) из 156 достигли стадии бластоцисты [30]. Аналогичная разница развития эмбрионов при использовании классического метода культивирования и сокультивирования с клетками кумулюса была продемонстрирована в исследовании Saito H. et al. [32].
В 2006 году Parikh F.R. с соавторами провели исследование, в котором оценивали влияние аутологичного сокультивирования эмбрионов с клетками кумулюса и эффективность переноса эмбриона с клетками кумулюса (Cumulus-Aid embryo Transfer, CAT). Осуществление переноса эмбриона с клетками кумулюса в программах ЭКО включает в себя культивирование эмбриона на слое кумулюсных клеток и проведение переноса эмбриона с некоторым количеством разреженных клеток кумулюса. В данное исследование было включено 517 пациенток, которым выполнялась стандартная программа ЭКО/ИКСИ. Далее пациентки были разделены на 2 группы: группа А из 267 пациенток с проведением аутологичного сокультивирования эмбрионов с клетками кумулюса и переносом эмбриона методом CAT и группа В из 250 пациенток с проведением аутологичного сокультивирования эмбрионов с клетками кумулюса и переносом эмбрионов без клеток кумулюса. Различий в средних возрастных группах, клинико-анамнестических данных и показаниях для использования методов ВРТ в обеих группах не было обнаружено. В группе А было получено 1489 ооцитов (5,6 ооцитов / цикл), из них 1266 (85%) были на стадии метафазы II. Перенос эмбрионов (от 2 до 4 эмбрионов) проводили на 3 сутки развития. В группе В было получено 1533 ооцита (6.1 ооцитов / цикл), из них 1225 (79,9%) были на стадии метафазы II. Показатели оплодотворения и дробления в группе А составили 73,1% и 100%, а в группе В – 71,8% и 100% соответственно. Среднее количество эмбрионов, перенесенных пациенткам в группах А и В составляло, соответственно, 3,1 и 3,2. Показатели частоты наступления беременности и имплантации в группе А составили 47,6% и 25,6%, а в группе В – 34% и 14,5%. Таким образом, исследование продемонстрировало значительное увеличение показателей частоты имплантации (25,6% против 14,5%, р<0,001), и наступления беременности (47,6% против 34%, р<0,01). Кроме того, показатели наступления многоплодной беременности были сопоставимы в группах А (n = 49, 38,6%) и B (n = 28, 32,9%). Более высокая частота наступления беременности была в группе А по сравнению с группой В (18,1% против 2,4%, р<0,01). Данное исследование продемонстрировало эффективность аутологичного сокультивирования эмбрионов с клетками кумулюса и переноса эмбрионов в полость матки методом CAT [24].
В 2012 году Benkhalifa M. с соавторами провели рандомизированное проспективное исследование. В исследование были включены 432 пациентки, имеющие не менее трех неудачных попыток ЭКО в анамнезе. Проводилась стандартная программа ЭКО/ИКСИ. Культивирование эмбрионов проводилось классическим методом и методом сокультивирования с клетками кумулюса, перенос осуществлялся на 3 или 5–6 сутки развития. Также была исследована экспрессия лейкемия – ингибирующего фактора (LIF) и фактора активации рецепторов тромбоцитов (PAF-R) на 3-й день сокультивирования с клетками кумулюса. Статистический анализ полученных данных продемонстрировал разницу в показателях имплантации и развития клинической беременности между классическим методом культивирования и сокультивированием, а также переносом на 3-й или 5–6 день. Частота наступления клинической беременности не отличалась в случае сокультивирования и классического метода культивирования с переносом на 3 (30,5% против 27,7%, р=0,65) или 5 день (46,3% против 41,5%, р=0,41). С другой стороны, отмечались различия между переносом на 3 и 5 дни в зависимости от того использовалось сокультивирование (30,5% против 46,3%, р=0,02) или же классический метод культивирования (27,7% против 41,5%, р=0,04). Наибольшая разница отмечалась между переносом эмбриона на 5 день с использованием метода аутологичного сокультивирования с клетками кумулюса и переносом эмбриона на 3-й день с классическим методом культивирования (46,3% против 27,7%, р<0,01). Молекулярный анализ показал, что клетки кумулюса участвуют в экспрессии генов LIF и PAF-R и подтвердили возможную положительную роль факторов роста и цитокинов на раннем этапе развития эмбрионов [33].
По данным исследования Karakaya C. et al. было выявлено, что «бедный» ответ у женщин в программе ЭКО ассоциирован с изменением экспрессии микроРНК в клетках кумулюса. Анализ экспрессии микроРНК продемонстрировал повышение экспрессии 16 микроРНК и снижение экспрессии 88 микроРНК у пациенток с «бедным» ответом на стимуляцию. Экспрессия микроРНК-21–5p была значительно повышена в образцах клеток кумулюса, полученных у пациенток с «бедным» ответом, в то время как экспрессия микроРНК-21–3p у них же была значительна ниже. В данном исследовании было продемонстрировано, что «бедный» ответ на стимуляцию суперовуляции связан с изменением экспрессии микроРНК в клетках кумулюса, в частности, с повышением уровня экспрессии микроРНК-21–5p [34].
Следует отметить, что апоптотическая активность в клетках кумулюса зависит от возраста женщин, а также связана с числом полученных при пункции ооцитов, их оплодотворением и наступлением беременности в результате ЭКО/ПЭ. Результаты одного из исследований свидетельствуют о том, что возможно использование клеток кумулюса для прогнозирования качества ооцитов, исхода ЭКО/ПЭ. В 34 циклах ЭКО у пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия и бесплодием неясного генеза, было аспирировано 330 ооцитов, из них 91 зрелый ооцит с клетками кумулюса. Распространенность апоптоза кумулюсных клеток оценивали с помощью набора флуоресцеина (APOPTEST-FITC). Полученные эмбрионы сокультивировали с аутологичными клетами кумулюса. Процесс апоптоза клеток кумулюса был более выражен у группы пациенток старше 40 лет со сниженным овариальным резервом и «бедным ответом» на стимуляцию суперовуляции по сравнению с группой женщин с удовлетворительным ответом на стимуляцию суперовуляции [35].
Vithoulkas A. et al. полагают, что существенные улучшения условий культивирования эмбрионов в программах ЭКО можно достичь благодаря использованию клеток кумулюса [36]. Положительное влияние сокультивирования проявлялось в ускоренном расщеплении, снижении клеточного апоптоза и увеличении количества бластоцист высокого качества. Показано, что сокультивирование эмбриона повышает частоту имплантации и наступления беременности у женщин с повторными неудачами имплантации [33].
В исследовании Vithoulkas A. et al. [36] эмбрионы культивировались с (1 группа) и без (2 группа) аутологичных кумулюсных клеток. Авторами было установлено, что в условиях сокультивирования дробление эмбрионов на ранних стадиях развития ускорялось, при этом бластомеры были более схожего размера, улучшалась морфология эмбрионов, что приводило к увеличению количества эмбрионов 1 класса и бластоцист, пригодных для криоконсервации.
С другой стороны, культивируемые эмбрионы в классической среде показали снижение темпов роста с неравными бластомерами и фрагментацией клеток. Общее количество эмбрионов 1 класса было существенно снижено. Кроме того, авторы получили значительное увеличение количества бластоцист 1 класса, полученных при сокультивировании, по сравнению с классическим методом культивирования (65% против 35,4%). Ранее при классическом методе культивирования общий показатель наступления беременности составлял 24%. С момента введения аутологичного сокультивирования в ЭКО общий показатель беременности увеличился до 36%. Результаты данной работы согласуются с другими аналогичными исследованиями, где кумулюсные клетки были использованы для совместного культивирования эмбрионов в программах ВРТ [33].
Факторы роста, секретируемые клетками кумулюса при совместном культивировании, частично ответственны за положительный эффект, наблюдаемый при развитии эмбрионов в программах ЭКО. В исследовании Vithoulkas A. et al. были обнаружены высокие концентрации VEGF-А (Vascular endothelial growth factor-А) и VEGF-С (Vascular endothelial growth factor-С). Выявлено, что эмбрионы при классическом методе культивирования не синтезируют эти два фактора роста, тогда как эмбрионы при аутологичном сокультивировании способны синтезировать VEGF-А и VEGF-C [36].
Таким образом, клетки кумулюса могут стать надежной моделью для понимания составляющих качества ооцитов, стимуляции яичников, оценки развития эмбриона, частоты наступления клинической беременности и рождения здорового ребенка в программах ВРТ [37–40].
