Evaluation of endometrial receptivity in patients with a history of failed in vitro fertilization programs

Leviashvili M.M., Demura T.A., Mishiyeva N.G., Faizullina N.M., Nazarenko T.A., Kogan E.A.

Academician V. I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health and Social Development of Russia, Moscow; Moscow Regional Research Institute of Obstetrics and Gynecology, Moscow
Objective: to make clinical, morphological, and immunohistochemical (IHC) evaluations of endometrial receptivity in women with a history of failed in vitro fertilization (IVF) programs.
Material and methods. Endometrial scrapes were examined in 36 infertile women with a history of failed IVF programs and 6 fertile women of reproductive age in the implantation window period.
Results. The endometrium of the patients with a history of IVF failures is characterized by decreased integumentary epithelial cells with the presence of mature pinopodia. IHC study of biopsy specimens showed an imbalance between steroid hormone receptors more frequently with a smaller number of estrogen receptors, as well as a lower expression of leukemia inhibitory factor with no tendency towards an enhanced cytokine expression from the deep endometrial histological layer to the more superficial one.

Keywords

endometrial receptivity
implantation window
leukemia inhibitory factor
pinopidia
in vitro fertilization

Среди многих причин нарушения фертильности большую роль играет снижение имплантационных
свойств эндометрия. Для осуществления успешной имплантации бластоцисты необходима не только нормальная анатомическая структура эндометрия, но и его функциональная состоятельность – адекватная восприимчивость в период «имплантационного окна».

Различные патологические изменения эндометрия могут приводить к нарушению его рецептивности и, как следствие, к дефектам имплантации (неоднократным неэффективным программам экстракорпорального оплодотворения – ЭКО или повторным абортам на ранних сроках беременности). Установлена прямая зависимость между частотой наступления и вынашивания беременности и благополучным состоянием слизистой оболочки матки [1, 5, 8]. В связи с этим с целью подготовки к программе ЭКО оправданно проводить комплексное обследование состояния эндометрия, оценку его органической и функциональной состоятельности и, при необходимости, коррекцию патологических изменений.

В практической деятельности клиницисты ограничены традиционными методами обследования, которые обладают низкой диагностической ценностью (ультразвуковое исследование, определение уровня стероидных гормонов в плазме крови). При изучении имплантационных свойств эндометрия в циклах обследования можно применить инвазивные методы, которые являются максимально диагностически ценными. Полученные при этом результаты формируют лечебную тактику при подготовке к ЭКО и в самих программах.

Эндометрий может находиться в различных функциональных состояниях, которые включают нейтральную, рецептивную и нерецептивную, или рефрактерную фазы [1, 4, 5, 11]. Именно рецептивность эндометрия (способность адекватно реагировать на циклические колебания уровней стероидных гормонов крови) формирует необходимые ультраструктурные изменения в эндометрии для возникновения «имплантационного окна» и, в конечном результате, обеспечивает имплантацию оплодотворенной яйцеклетки, наступление и развитие беременности. Специфическим морфологическим маркером полноценной рецептивности эндометрия является появление пиноподий в покровном эпителии [4, 5, 8, 9, 19]. Пиноподии визуализируются в виде эктоплазматических протрузий на апикальной поверхности эпителиоцитов. Их активность ограничена коротким временнdм периодом, соответствующим «окну имплантации», который, по данным литературы, продолжается 36–48 часов [1, 9, 16].

В естественном менструальном цикле полное развитие пиноподий (расцвет) происходит на 6–8-й день после овуляции (19–23-й день менструального цикла) [1, 4, 7–9, 11]. При этом в зависимости от площади, занимающей эпителиальный покров, пиноподии характеризуются как изобилующие, умеренные и не выраженные (более 50, 20–50, менее 20% соответственно) [6, 10, 11].

Как известно, основными регуляторами морфологических и функциональных изменений в эндометрии в течение менструального цикла являются синтезируемые в яичниках стероиды (эстрогены и прогестерон) [3, 5, 10].

Поскольку действие стероидных гормонов осуществляются путем связывания со специфическими ядерными рецепторами функционального слоя эндометрия, логично предположить, что дефект экспрессии прогестероновых (ПР) и эстрогеновых (ЭР) рецепторов может привести к нарушению морфофункциональных свойств эндометрия в период «имплантационного окна». Решающим является не столько абсолютное содержание стероидных гормонов в плазме крови, сколько количество и соотношение полноценных рецепторов в эндометрии [3, 5, 12, 21]. Таким образом, определение ПР и ЭР методом иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания препаратов с биоптатами (их концентрация и соотношение между собой) в средне секреторную фазу позволяет уточнить и дополнить патоморфологическое исследование и может стать одним из ценных диагностических маркеров восприимчивости эндометрия к эмбриону [3–5].

Под влиянием стероидных гормонов находится не только появление и созревание пиноподий, но и экспрессия большинства идентифицированных молекул, вовлеченных в процесс имплантации эмбриона. Наиболее активно в литературе обсуждается вклад в процесс имплантации фактора, ингибирующего лейкемию (ЛИФ). Этот цитокин присутствует практически во всех клеточных структурах и тканях репродуктивного тракта. Функцию ЛИФ можно проследить на самых различных этапах репродуктивных процессов, начиная с роста и развития гамет и заканчивая наступлением и прогрессированием беременности [2, 13–15].

Наиболее интересными оказались результаты исследования функции ЛИФ в эндометрии человека, где этот цитокин продуцируется в течение всего менструального цикла и достигает максимума в средне секреторную фазу, в период «имплантационного окна», что сопряжено с максимальным числом зрелых пиноподий [12, 14, 18, 20].

В связи с этим интерес исследователей сосредоточен на выявлении диагностической ценности определения числа эпителиальных клеток с наличием зрелых пиноподий, характером экспрессии стероидных рецепторов и уровнем экспрессии цитокина ЛИФ в оценке имплантационных возможностей и рецептивности эндометрия. Не до конца изученными остаются также особенности рецептивности эндометрия у пациенток различных клинических групп.

Целью данного исследования явилась клиникоморфологическая и ИГХ оценка рецептивности эндометрия у женщин с безуспешными программами ЭКО в анамнезе на основании определения числа клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий, изучения характера экспрессии рецепторов к стероидным гормонам и ЛИФ.

Материал и методы исследования

Исследованы образцы функционального слоя эндометрия 42 женщин, взятые на 19–25-й день овуляторного менструального цикла в период предположительного «имплантационного окна». Из них – 36 женщин основной группы с неудачными попытками ЭКО в анамнезе и 6 фертильных женщин репродуктивного возраста, составивших группу контроля.

У пациенток, включенных в исследование, проводили морфологическую и ИГХ оценку биоптатов функционального слоя эндометрия, полученных в период «имплантационного окна» овуляторного
менструального цикла.

Критериями исключения пациенток из исследования явились: применение оральных или внутриматочных средств контрацепции в течение последних 6 мес и наличие признаков органической патологии эндометрия (хронического эндометрита и гиперпластических процессов).

Биопсию эндометрия проводили в асептических условиях без предварительной анестезии из области дна матки с помощью аспирационной кюретки на 6–8-й день после овуляции. Овуляция отслеживалась совместно с помощью двух методов: ультразвукового мониторинга цикла, а также определения пика ЛГ в моче. Материалы биоптатов фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24 часов. Образцы были обработаны по общепринятой стандартной методике и заключены в парафин. Срезы толщиной 5 мкм готовили на роторных микротомах и окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование гистологических препаратов проводили в световом микроскопе при увеличении от х50 до х400. Гистологическое датирование эндометрия, оценку процента клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий осуществляли в световом микроскопе при увеличении х400 в 5 полях зрения. ИГХ реакции проводили на депарафинированных срезах толщиной 4–5 мкм по общепринятым протоколам (DAKO protocols).

Определение стероидных рецепторов проводилось с использованием мышиных моноклональных антител к ЭРα (клон 1D5 «DAKO», США; разведение 1:35) и ПР (клон 636 «DAKO», США; разведение 1:50). Для выявления экспрессии ЛИФ использовали первичные антитела к ЛИФ (R@D Systems, USA, clone: 9824, mouse anti-human antibody).

Результаты для ЭР и ПР анализировали с учетом количества окрашенных клеток и интенсивности
окраски в поверхностном эпителии, железах и строме эндометрия, используя метод гистологического счета HISTO Score по формуле: HS=1а+2b+3c, где а – % слабо окрашенных клеток, b – % умеренно окрашенных клеток, с – % сильно окрашенных клеток. 1, 2, 3 – интенсивность окрашивания, выраженная в баллах. Степень выраженности экспрессии ЭР и ПР расценивали как: 0–10 % – отсутствие экспрессии, 11–100 % – слабая экспрессия, 101–200% – умеренная экспрессия, 201–300 % – выраженная экспрессия. Результаты ИГХ реакции для ЛИФ оценивали полуколичественным методом в баллах по общепринятой методике: отсутствие иммуноокрашенных клеток (-) – 0 баллов; менее 5% иммуноокрашенные клетки (±) – 0,5 балла, менее 20% иммуноокрашенных клеток (+) – 2 балла; от 20 до 40% окрашенных клеток (++) – 4 балла; более 40% окрашенных клеток (+++) – 6 баллов.

Результаты исследования

Возраст пациенток группы исследования (n=36) колебался от 26 до 39 лет и в среднем составил
33,1±3,35 года. Первичное бесплодие отмечено у 21 (61 %), а вторичное – у 13 (39%) пациенток. Продолжительность бесплодия колебалась от 3 до 14 лет (в среднем 6,5± 3,2 года).

Пациентки группы исследования готовились к продолжению лечения бесплодия методом ЭКО. Всем им
ранее было проведено от 1 до 3 попыток ЭКО, при этом регистрировались адекватные параметры фолликулогенеза (от 7 до 18 фолликулов преовуляторного размера), оогенеза (получено от 6 до 15 зрелых ооцитов хорошего качества) и эмбриогенеза (число эмбрионов хорошего качества от 5 до 10). Толщина и структура эндометрия, по результатам ультразвукового мониторинга, в программах ЭКО не отличались от нормы: в преовуляторный период 9±1,9 мм с «трехслойной» структурой, а в день переноса эмбрионов наблюдался эндометрий с характерной секреторной трансформацией, толщиной 11±2 мм.

Группу контроля составили женщины репродуктивного возраста, имеющие регулярный менструальный
цикл и подтвержденную фертильность (хотя бы одну самостоятельную беременность и роды в анамнезе). В контрольной группе (n=6) при морфологическом исследовании биоптатов наблюдали эндометрий ранней и средней стадий фазы секреции. При изучении поверхностного эпителия и оценке числа клеток с наличием пиноподий, было обнаружено, что в среднем 50% клеток поверхностного эпителия содержат зрелые пиноподии (от 40 до 60%). При ИГХ исследовании выявлено высокое и умеренное содержание ПР и ЭР как в железистых структурах, так и в ядрах клеток стромы (рис. 1, cм. на вклейке). Соотношение рецепторов ПР/ЭР оказалось в диапазоне от 2 до 5 и в среднем составило 2,9. У пациенток этой группы отмечалась высокая экспрессия ЛИФ (5–6 баллов) как в апикальной части покровного эпителия, так и в железах.

В группе исследования у 18 женщин выявлены признаки хронического эндометрита (наличие в эндометрии воспалительных инфильтратов, очаговое фиброзирование стромы), а у одной пациентки – признаки гиперплазии эндометрия без атипии. Данные пациентки были исключены из исследования, им была предписана специфическая терапия. Остальные биоптаты, полученные от 27 женщин, у которых не выявили органической патологии эндометрия, были подготовлены для последующего ИГХ исследования. У 26 из них морфологическая картина эндометрия соответствовала ранней и средней стадиям фазы секреции, а у одной женщины наблюдался эндометрий поздней стадии фазы пролиферации. У этой пациентки бесплодие было обусловлено эндокринным фактором. Обследование проводилось в цикле с собственной овуляцией. В день забора биоматериала при ультразвуковом исследовании органов малого таза была зарегистрирована толщина эндометрия 8 мм, структура эндометрия – трехслойная. Уровень прогестерона в периферической крови составил 32 пмоль/л. Был сделан вывод, что у данной пациентки имелись клинические признаки недостаточности лютеиновой фазы, что в дальнейшем и было подтверждено результатами морфологического исследования соскоба эндометрия.

Число клеток поверхностного эпителия, покрытых пиноподиями, у пациенток группы исследования и контроля, %

При гистологическом исследовании образцов, полученных от женщин, составивших группу исследования, выявлено, что в среднем 24% клеток поверхностного эпителия содержат пиноподии (от единичных до 50 % клеток) (рис. 2).

При ИГХ исследовании биоптатов в целом наблюдалась умеренная и выраженная экспрессия ПР во
всех клетках эндометрия. В железах и в строме уровень экспрессии ПР колебался от 4 до 250% по сис-
теме оценки HISTO Score, что в среднем составило 151±22 и 130±13,5% соответственно. При оценке иммуноокрашивания ЭР-образцов пациенток группы исследования была отмечена умеренная и низкая экспрессия ЭРα. В железах и строме уровень ЭРα колебался от 1 до 250 и составил в среднем 95±12,6 и 51,3±11,2 соответственно.

Соотношение ПР/ЭР у пациенток групп исследования и контроля

Что касается соотношения рецепторов стероидных гормонов в эндометрии, то этот показатель рассчитывается по соотношению ПР/ЭР в строме. По данным литературы, в норме он составляет от 2 до 4 [5]. У пациенток группы исследования ПР/ЭР колебался от 1 до 180 и в среднем составил 7,7 (что отражает снижение количества ЭР), в группе сравнения этот показатель составил 2,9 (рис. 3).

Сравнение экспрессии цитокина ЛИФ в поверхностном эпителии эндометрия у пациенток групп контроля и исследования

В результате ИГХ исследования биоптатов эндометрия женщин группы контроля отмечена высокая
степень экспрессии цитокина ЛИФ (5–6 баллов), тогда как в образцах, полученных у пациенток с безуспешными программами ЭКО в анамнезе, экспрессия этого биомаркера варьировалась от высокого до полного отсутствия (рис. 4).

При анализе особенностей распределения ЛИФ в клетках функционального слоя эндометрия у пациенток с безуспешными попытками ЭКО в анамнезе было отмечено отсутствие тенденции к усилению экспрессии ЛИФ от более глубокого гистологического слоя к поверхностному. В группе фертильных женщин такая тенденция отчетливо прослеживалась. В целом отмечено снижение уровня ЛИФ во всех рассматриваемых гистологических структурах эндометрия в группе исследования.

Обсуждение

Поиску эффективных методов оценки имплантационного потенциала эндометрия посвящено много исследований. Однако клиническая интерпретация результатов этих исследований пока крайне ограничена. В настоящей работе проведена оценка рецептивности эндометрия у 36 женщин, имеющих от 1 до 3 неудачных попыток ЭКО в анамнезе. При этом параметры фолликуло-, оо- и эмбриогенеза были адекватными. Динамика роста и структурной трансформации эндометрия в ходе программ соответствовала адекватной эхографической картине. Более того, у большинства больных (кроме одной), при морфологическом датировании в период предполагаемой максимальной рецептивности эндометрия обнаружен эндометрий ранней и средней стадий фазы секреции, что не отличалось от такового в группе сравнения. Все это явилось предпосылкой для более углубленного исследования имплантационных свойств эндометрия у данной группы больных.

И действительно, число клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий в период
предполагаемого «имплантационного окна» различалось в группе исследования и сравнения (в среднем 24 и 50% соответственно). Снижение количества эндометриальных пиноподий было отмечено исследователем G. Nikas у пациенток с нарушением имплантации в анамнезе и у женщин с бесплодием неясного генеза [19].

Также у пациенток, составивших группу исследования, отмечен дисбаланс в экспрессии рецепторов к стероидным гормонам, в основном за счет снижения количества ЭР. Аналогичные результаты были представлены в работах Е.А. Дюжевой и S. Talbi. Связи между экспрессией рецепторов к стероидным гормонам и выраженностью эндометриальных пиноподий или экспрессией ЛИФ не отмечено [3, 5, 17].

По результатам проведенного нами исследования, экспрессия цитокина ЛИФ в преимплантационном эндометрии у женщин с неудачными попытками ЭКО в анамнезе достоверно снижена по сравнению с группой сравнения, что подтвердило высокую диагностическую роль определения экспрессии ЛИФ в эндометрии средне секреторной фазы. Также была отмечена связь между экспрессией ЛИФ и эндометриальными пиноподиями, в период расцвета которых и
определяется максимальная концентрация цитокина, что согласуется с данным, полученным L. Aghajanova и соавт. [1, 2].

В настоящее время возможности клиницистов ограничены лишь традиционными методами улучшения рецептивных свойств эндометрия (применение циклической гормональной терапии). Многообещающими являются исследования о применении рекомбинантного ЛИФ для улучшения имплантационных свойств эндометрия у женщин с бесплодием. Однако возможность патогенетической терапии (применение рекомбинантного ЛИФ), направленной на улучшение имплантационных возможностей эндометрия, остается пока далекой перспективой.

Выводы

Эндометрий пациенток, имеющих безуспешные попытки ЭКО в анамнезе, при морфологическом
исследовании характеризуется снижением числа клеток покровного эпителия с наличием зрелых пиноподий. При ИГХ исследовании биоптатов в 60% случаев отмечен дисбаланс между рецепторами к стероидным гормонам в эндометрии, чаще в сторону снижения количества ЭР, а также снижение экспрессии ЛИФ с отсутствием тенденции к усилению экспрессии цитокина от глубокого гистологического слоя эндометрия к более поверхностному.

Такие биомаркеры, как экспрессия ЛИФ и число клеток поверхностного эпителия, содержащих пиноподии, наиболее точно отражают имплантационный потенциал эндометрия и, несомненно, являются наиболее ценными диагностическими признаками его полноценности.

References

1. Agadzhanova L. Jendometrial'nye pinopodii kak markery implantacii cheloveka (obzor literatury) // Probl. Reprod. – 2004. – № 3. – S. 6–11.
2. Ambarcumjan Je.M., Agadzhanova L.M. Rol' faktora, ingibirujuwego lejkemiju v reprodukcii cheloveka // Akusherstvo i ginekologija. – 2004. – № 2. – S. 17–21.
3. Babichenko I.I., Samojlov M.V., Serebrennikova K.G., Bessmertnaja V.S., Musaeva M.G. Receptory k jestrogenam i progesteronu v jendometrii zhenwin pri besplodii // Vestnik RUDN. – 2007. – № 2. – S. 48–52.
4. Gjul'mamedova I.D., Mezhova O.K., Problemy implantacii v programme IVF (obzor literatury) // Novosti mediciny i farmacii. – 2008. – № 253. – R. 17–27.
5. Djuzheva E.V. Gormonal'naja podgotovka jendometrija u pacientok s nejeffektivnymi popytkami jeko v anamneze: Avtoref. diss. ... kand. med. nauk. M., 2010.
6. Kogan E.A., Kalinina E.A., Kuz'michev L.N., Djuzheva E.V. Immunogistohimicheskoe issledovanie jendometrija v programmah VRT // Vestnik RUDN. – 2009. – № 6. – S. 98–104.
7. Mishnev O.D., Samojlov M.V., Serebrennikova K.G., Bessmertnaja V.S. Jendometrial'noe "okno implantacii" pri besplodii // Arhiv patologii. – 2011. – № 3. – S. 13–18.
8. Mishnev O.D., Chernikov V.P., Samojlov M.V., Serebrennikova K.G., Bessmertnaja V.S. Algoritm kliniko-morfologicheskogo obsledovanija jendometrija pri podgotovke k lecheniju besplodija metodami vspomogatel'nyh reproduktivnyh tehnologij // Rossijskij medicinskij zhurnal. – 2009. – № 2. – S. 29–32.
9. Ol'hovskaja M.A. Biomarkery implantacionnogo okna (obzor literatury) // Probl. Reprod. – 2007. – № 1. – S.72–77.
10. Ol'hovskaja M.A. Kompleksnaja ocenka sostojanija jendometrija v programme JeKO Avtoref. diss. ... kand. med. nauk. M., 2007.
11. Achache H., Revel A. Endometrial receptivity markers, the journey to successful embryo implantation // Human. Reprod. Update. – 2006. – Vol. 12, № 6. – R. 731–746.
12. Aghajanova L., Skottman H., Stromberg A.M. et al. Uterine receptivity to human embryonic implantation: histology, biomarkers, and transcriptomics // Semin. Cell. Dev. Biol. – 2008. – Vol.19, № 2. – R. 204–211.
13. Aplin J.D., Kimber S.J. Trophoblast-uterine interactions at implantation // Reproductive Biology and Endocrinology. – 2004. – № 2. – R. 48.
14. Arici A., Engin O., Attar E., Olive D.L. Modulation of leukemia inhibitory factor gene expression and protein biosynthesis in human endometrium // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 1995. – № 80. – R. 1908–1915.
15. Cheng J.G., Chen J.R., Hernandez L. et al. Dual control of LIF expression and LIF receptor function regulate Stat3 activation at the onset of uterine receptivity and embryo implantation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2001. – № 98. – R. 8680–8685.
16. Develioglu O.H., Nikas G., Hsiu J.G. et al. Detection of endometrial pinopodes by light microscopy // Fertil. Steril. – 2000. – № 74. – R. 767–770.
17. Hess A.P., Hamilton A.E., Talbi S. Decidual stromal cell response to paracrine signals from the trophoblast: amplification of immune and angiogenic modulators // Biol. Reprod. – 2007. – Vol. 76, № 1. – R. 102–117.
18. Marwood M., Visser K. Interleukin-11 and leukemia inhibitory factor regulate the adhesion of endometrial epithelial cells: implications in fertility regulation // Endocrinology. – 2009. – Vol. 150, № 6. – R. 2915–2923.
19. Nikas G., Aghalanova L. Endometrial pinopodes: some more understanding on human implantation // Reprod. Biomed. Online. – 2002. – Vol. 4, № 3. – R. 18–23.
20. Sherwin J.R., Smith S.K., Wilson A., Sharkey A.M. Soluble gp130 is up-regulated in the implantation window and shows altered secretion in patients with primary unexplained infertility // .J Clin. Endocrinol. Metab. – 2002. – № 87. – R. 3953–3960.
21. Stavreus-Evers A., Nikas G. Formation of pinopodes in human endometrium is associated with the concentrations of progesterone and progesterone receptors // Fertil. Steril. – 2001. – Vol. 76. № 4. – R. 782–791

About the Authors

LEVIASHVILI Mzia Merabovna, Third-Year Postgraduate Student, Academician V.I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health and Social Development of Russia
Address: 4, Academician Oparin St., Moscow 117997
Telephone: +7 (495) 438-23-11
E.mail: mziyalevi@yandex.ru

DEMURA Tatiana Aleksandrovna, Senior Researcher, Academician V.I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health and Social Development of Russia
Address: 4, Academician Oparin St., Moscow 117997
Telephone: +7 (495) 438-23-11
E.mail: t_demura@oparina4.ru

MISHIYEVA Nona Godovna, Leading Researcher, Gynecology Department One, Academician V.I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health and Social Development of Russia
Address: 4, Academician Oparin St., Moscow 117997
Telephone: +7 (495) 438-26-22
E.mail: n_mishieva@oparina4.ru

FAIZULLINA Nafisa Munavarovna, Senior Researcher, Morbid Anatomy Department One, Academician V.I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health and Social Development of Russia
Address: 4, Academician Oparin St., Moscow 117997
Telephone: +7 (495) 438-23-11
E.mail: n_faizullina@oparina4.ru

NAZARENKO T.A.

Professor KOGAN Evgenia Altarovna, MD, Morbid Anatomy Department One, Academician V.I. Kulakov Research Center of Obstetrics, Gynecology, and Perinatology, Ministry of Health and Social Development of Russia
Address: 4, Academician Oparin St., Moscow 117997
Telephone: +7 (495) 438-23-77
E.mail: e_kogan@oparina4.ru

Similar Articles

By continuing to use our site, you consent to the processing of cookies that ensure the proper functioning of the site.